發(fā)夾式siRNA活化結(jié)直腸癌高甲基化抑癌基因的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、CpG島(CpGislands)高甲基化所致抑癌基因表觀遺傳學(xué)沉默(epigeneticsilencing)是腫瘤發(fā)生學(xué)的重要機(jī)制之一，已成為腫瘤表觀遺傳學(xué)組(cancerepigenomics)和人類表觀基因組計(jì)劃(HumanEpigeneticProjects，HEP)的重要研究?jī)?nèi)容。所謂表觀遺傳學(xué)是指基于非基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化，如DNA甲基化、染色體轉(zhuǎn)位等。在表觀遺傳學(xué)的研究中，DNA甲基化一方面與人類發(fā)育進(jìn)程密切相關(guān)

2、，在人類發(fā)育過(guò)程中起著重要的基因表達(dá)調(diào)節(jié)作用，另一方面，它與腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展也有著極為重要的密切關(guān)系。 結(jié)直腸癌是人類常見(jiàn)腫瘤疾病。抑癌基因CpG島高甲基化是結(jié)直腸癌發(fā)生學(xué)重要機(jī)制之一，它不僅與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展直接相關(guān)，還與基因突變/染色體不穩(wěn)定和微衛(wèi)星不穩(wěn)定的進(jìn)行性演變直接相關(guān)。在結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生學(xué)中，CpG島甲基化異常機(jī)制累及的抑癌基因很多，如DNA修復(fù)(MLH1、MGMT)和細(xì)胞周期調(diào)控(p16、p53)基因等。由于抑癌

3、基因的CpG島高甲基化現(xiàn)象是可以逆轉(zhuǎn)的表觀遺傳學(xué)修飾過(guò)程，并且該逆轉(zhuǎn)(CpG島去甲基化)可直接恢復(fù)抑癌基因的功能，此外，結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞hDNMT1(humanDNAmethyltransferase1)的過(guò)度表達(dá)又是導(dǎo)致抑癌基因CpG島高甲基化的關(guān)鍵因素，因此，特異性抑制hDNMT1的活性有可能使高甲基化轉(zhuǎn)錄失活的抑癌基因恢復(fù)基因表達(dá)和生物學(xué)功能，從而使結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變。 RNA干擾(RNAi)是由dsRNA介導(dǎo)

4、的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，當(dāng)外源導(dǎo)入的dsRNA被Dicer酶切割成19-23nt的小分子干擾RNAs(siRNA)后，與體內(nèi)其他成分聚合形成RNA誘導(dǎo)型基因沉默復(fù)合體(RISC)，然后活化的RISC可導(dǎo)致與siRNA互補(bǔ)靶序列的降解，從而導(dǎo)致特異的基因沉默效應(yīng)。RNAi技術(shù)在基因敲除或誘導(dǎo)基因沉默等方面都取得了可喜成果，這些為本課題選擇RNAi機(jī)制來(lái)抑制hDNMT1的表達(dá)提供了理論依據(jù)。 本研究首先設(shè)計(jì)靶向hDNMT1mRNA不同

5、位置的hsiRNA913和hsiRNA1620兩條發(fā)夾式siRNA，并以此為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增方式在體外制備可特異性誘導(dǎo)hDMMT1RNAi的SEC913和SEC1620兩條siRNA表達(dá)盒(siRNAexpressioncassette，SEC)，然后將SEC913和SEC1620分別轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116；隨后，將SEC913和SEC1620克隆至pSECneo發(fā)夾式siRNA表達(dá)載體，分別構(gòu)建pSECneo913和pSE

6、Cneo1620表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116和SW480。最后，以β-actin為內(nèi)對(duì)照，采用半定量RT-PCR觀察和分析在SEC913、SEC1620、pSECneo913和pSECneo1620轉(zhuǎn)染的HCT116和SW480細(xì)胞株中，hDNMT1在不同時(shí)相點(diǎn)的表達(dá)水平及其變化趨勢(shì)與特點(diǎn)，以分析和評(píng)價(jià)上述RNAi技術(shù)對(duì)hDNMT1表達(dá)抑制的特異性和效率；同時(shí)，采用半定量RT-PCR和MSP(methylationsp

7、ecificPCR)方法，分別觀察p16、MGMT和hMLH1三種抑癌基因的基因表達(dá)水平和CpG島甲基化水平，以評(píng)價(jià)和分析hDNMT1表達(dá)抑制作用是否可導(dǎo)致抑癌基因高甲基化水平的逆轉(zhuǎn)，并且該逆轉(zhuǎn)可恢復(fù)上述抑癌基因的表達(dá)和功能。 研究結(jié)果表明，體外制備的SEC913和SEC1620，以及發(fā)夾式siRNA表達(dá)載體pSECneo913和pSECneo1620均可導(dǎo)致轉(zhuǎn)染細(xì)胞株HCT116和SW480中hDNMT1表達(dá)水平不同程度的下降

8、；此外，發(fā)夾式siRNA的作用時(shí)效性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于體外制備的SEC913和SEC1620，提示發(fā)夾式siRNA表達(dá)載體可提供長(zhǎng)期有效的RNAi作用，因此，它們?cè)谂R床表觀遺傳學(xué)治療方面具有更好的潛在應(yīng)用價(jià)值。此外，hDNMT1的表達(dá)抑制作用可導(dǎo)致p16和MGMT基因CpG島甲基化水平降低或逆轉(zhuǎn)，并可觀察到這些抑癌基因表達(dá)水平恢復(fù)或增高，提示抑癌基因高甲基化水平的逆轉(zhuǎn)可恢復(fù)或增強(qiáng)其表達(dá)水平。上述研究結(jié)果表明，本研究通過(guò)RNAi特異性抑制hDNMT