大鼠血栓調(diào)節(jié)蛋白核心片段的克隆表達與活性測定.pdf

1、目的：血栓性疾病具有極高的發(fā)病率和死亡率，已經(jīng)成為嚴重的公共健康問題之一。TM是內(nèi)皮細胞廣泛表達的膜蛋白，在凝血和纖溶方面起著重要作用，其抗炎和抗增值作用也已被證實。TM還是內(nèi)皮損傷的標志物，心肌梗死、腦梗死、紅斑狼瘡、糖尿病和腎病患者的血漿中都會檢測到其降解片段。TM對血栓性疾病的診斷和治療有著重要意義。本實驗旨在以pGEX—5X—3質(zhì)粒為表達載體，構(gòu)建含有重組質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)菌株，誘導表達大鼠TM基因核心片段E

2、GF4—6融合蛋白，并對其進行純化和活性測定。 方法：1、PCR擴增TM核心片段。通過Primer Premier5.0軟件設計大鼠TM基因核心片段EGF4—6的引物，以大鼠基因組DNA為模板，進行PCR擴增，用0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物并進行純化。2、目的基因的克隆及測序。將回收的PCR片段與pMD18-T simple vector連接，T—A克隆產(chǎn)物經(jīng)Eco RI和SalⅠ雙酶切，純化回收后與經(jīng)同樣雙酶切的表達載

3、體pGEX—5X—3由T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5a感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒，酶切分析，并測序鑒定其DNA序列，將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞。3、融合蛋白的誘導表達。按1％比例接種至LB培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)3h，A600約為0.5時，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，30℃誘導5h，分別于1h，2h，3h，4h，Sh取樣，用凝膠濃度為10％的SDS-PAGE檢測，考馬斯亮藍R2

4、50染色，同時以含空載pGEX—5X—3質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)及空宿主菌作為對照。4、融合蛋白的純化。將融合蛋白樣品超聲破碎后離心取上清通過0.45μm微孔濾膜，以0.4ml/min流速過柱。用PBS沖洗10min，流速為1.0ml/min，再用含有10mmol/L的GSH洗脫液洗脫融合蛋白，流速為1.0ml/min，洗脫10min。收集洗脫液于離心管中，于凝膠濃度為10％的SDS-PAGE檢測。5、融合蛋白的活性測定。

5、取30份新鮮的大鼠血漿，每份100μl，加入部分凝血活酶100μl，分別加入按100％、75％、50％、25％、0％稀釋的融合蛋白溶液，37℃預熱5min，然后加入CaCl2溶液100μl，加入的同時開始計時，記錄血漿凝固時間，并以同樣稀釋度的標簽蛋白溶液作為對照。重復3組上述操作。 結(jié)果：1、TM基因核心片段的PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約556bp的目的基因片段，位置正確，條帶清晰，無非特異性擴增

6、帶。PCR擴增成功。2、克隆載體與表達載體的鑒定。pMD18-T simple vector大小約2700bp，將陽性克隆pMD18-T simplevector/TM經(jīng)Eco RI和SalⅠ分別進行單酶切，并進行雙酶切，電泳檢測有相應大小的目的條帶，經(jīng)過測序分析，編碼序列與Genbank公布的一致。含目的基因的重組質(zhì)粒pGEX—5X—3/TM經(jīng)酶切后電泳檢測，條帶大小與預期大小一致，質(zhì)粒構(gòu)建成功。3、融合蛋白的表達及純化。經(jīng)SDS-P

7、AGE分析，重組菌所在泳道有相對分子質(zhì)量約為47000的融合蛋白表達，在溫度為30℃條件下，IPTG濃度為0.5mmol/L，誘導4h時，融合蛋白的誘導表達量最高。重組蛋白主要以包涵體形式存在，經(jīng)過BandScan5.0軟件分析，融合蛋白表達量占菌體蛋白總量的45％。利用GSTrap FF蛋白純化預裝柱得到了純凈的融合蛋白溶液。4、蛋白的活性測定。以稀釋度為橫坐標，以3組重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒，對應凝血時間的平均值為縱坐標構(gòu)建坐標圖。利用S

8、PSS統(tǒng)計軟件，重組質(zhì)粒的凝血時間與稀釋度經(jīng)直線回歸分析有統(tǒng)計相關(guān)性(r=0.955，P<0.05)，而空載質(zhì)粒的凝血時間與稀釋度無統(tǒng)計相關(guān)性(r=-0.680，P>0.05)?？寺”磉_的TM基因核心片段EGF4—6融合蛋白是具有生物活性的。 結(jié)論：完成了引物設計和目的基因的擴增，并對PCR條件進行了優(yōu)化。成功構(gòu)建了克隆質(zhì)粒pMD18-T simple vector/TM和重組質(zhì)粒pGEX—5X—3/TM，表達菌株E，coliB