血栓調(diào)節(jié)蛋白和血栓性疾病

1、抗凝物質(zhì) -----啟動蛋白C(protein C，PC) 抗凝途徑的重要輔因子 通過與凝血酶結(jié)合形成TM-凝血酶復(fù)合物參與機體抗凝和纖溶，與血栓形成有著密切的關(guān)系,凝血酶調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin，TM),抗凝機制,Ⅲ（TF）

2、 Ⅹa

3、 凝血酶 凝血酶

4、 抑制（激活）纖溶系統(tǒng),內(nèi)源,外源,Ⅻa Ⅺ Ⅸa,,,,,Ⅷa Ⅴ,Ⅶa Ⅹa,,,AT-Ⅲ,HC Ⅱ,P C APC PS,TFPI,,,,,TM+凝血酶,,,TM的概況 1960年，Mammen發(fā)現(xiàn)含凝血酶血漿具有抗凝作用 1976年，Stenflo

5、證明這種抗凝物質(zhì)是蛋白C 如何？ PC APC 1981年，Esmon首先從兔肺中分離出純化 TM 激活蛋白C

6、 1984年， Salem 分離 人胎盤TM 1986年，Jacubowski 分離牛TM 1988年，Kumada分離鼠TM 1987年， Jackman RW將人TM的cDNA分離、測序 重組人TM合成,APC+鈣離子+PS 降解 Ⅴa和Ⅷa 抗凝作用,,,,,,,PC的抗凝

7、途徑經(jīng)典試驗 純合子PC缺乏--------新生兒爆發(fā)性紫癜 雜合子PC缺乏--------一部分患有血栓 PC水平減少----------DIC有關(guān)（DIC指標）,APC+鈣離子+PS 降解 Ⅴa和Ⅷa 抗凝,,,TM的結(jié)構(gòu)由557個氨基酸構(gòu)成的、不具備

8、內(nèi)在酶活性的1型跨膜糖蛋白 胞外區(qū)----496個氨基酸 1-226個氨基酸組成的第一區(qū)域 227-462個氨基酸組成的第二區(qū)域，由6個表皮生長因子(ＥＧＦ)

9、 樣結(jié)構(gòu)區(qū)（1——6區(qū)）組成的重復(fù)序列 組成 富含絲氨酸/蘇氨酸的第三區(qū)域，第6個EGF分子區(qū)和跨膜區(qū)域之間 跨膜序列----23個氨基酸 含2個半胱氨酸的單鏈跨膜區(qū)域，即第四區(qū)域

10、 胞內(nèi)區(qū)----38個氨基酸 為一短的尾部，即胞漿區(qū)或第五區(qū)域,,,TM五個區(qū)域（功能上） 第一區(qū)域----不參與激活活化蛋白C的過程，但為受體介導(dǎo)的胞吞所 必需，參與內(nèi)皮細胞在腫瘤生長和炎癥過程中的調(diào)節(jié) 第二區(qū)域----4－6區(qū)有重要的鈣離子結(jié)合點，為蛋

11、白C活化所必需 第三區(qū)域----附加硫酸軟骨素部分對TM與凝血酶的結(jié)合起穩(wěn)固作用 第四區(qū)域----人血尿中有活性的TM可能來源于分解的跨膜成分 第五區(qū)域----胞漿區(qū)，與TM的內(nèi)吞和降解有關(guān),,TransmembraneCytoplasmic Rich Ser/Thr EGF-Repeats Lectin Like ⑤

12、④ ③ Ca ② ①

13、PC Activating Thrombin BindingCOOH

14、 NH3 Plasma Membrane TM的結(jié)構(gòu)和cDNA克隆示意圖,,,,,,,,,,,,,,,,6,5,4,3,2,1,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,TM的合成和表達 血管、淋巴管的內(nèi)皮細胞

15、 人胚胎組織中的合體滋養(yǎng)層細胞 中性粒細胞、單核細胞、血小板、間皮細胞 血、尿、關(guān)節(jié)組織----以維持血液、淋巴液、滑液呈液 體狀態(tài)，以防凝塊,,TM－凝血酶復(fù)合物 ?如何結(jié)合？ 內(nèi)皮膜上的TM與凝血酶有很強的結(jié)合力

16、，以1：1的比例形 成TM－凝血酶復(fù)合物 TM上的硫酸軟骨素部分，提供另一個參與PC活化的凝血酶 結(jié)合位點，可增加TM與凝血酶的親和力10-20倍 TM－凝血酶復(fù)合物的形成使凝血酶構(gòu)型發(fā)生改變，在鈣離子 參與下，特異結(jié)合蛋白C，發(fā)揮TM的抗凝作用 ?由于TM－凝血酶復(fù)合物的形成，抑制了凝血酶與纖維蛋白原 和蛋白

17、酶激活受體-1（PAR-1）的相互結(jié)合 ?由于TM－凝血酶復(fù)合物的形成，遮蓋和抑制了血小板上的 凝血酶受體，抑制血小板與內(nèi)皮的黏附和聚集,,Thrombomodulin protein C,,,,,Protein CReceptor(EPCR),Thrombin,+Protein S,Activated

18、Protein C,,fibringen receptor? platelet +,,,,,,,,,1.Physiological anticoagulation2.Modulation of pro-inflammatory reponse,,,蛋白C途徑模型,,TM的功能 ?加速蛋白C的激活： 作為強的蛋白

19、C激活物，TM能使依賴凝血酶的蛋白C活化過程加快兩個以上的數(shù)量級。 ?降低凝血酶的功能： TM介導(dǎo)調(diào)控體內(nèi)重要的兩種抗凝機制 ? 抑制凝血酶的促凝結(jié)構(gòu)------因微血管系統(tǒng)富含TM，這種環(huán)境下所產(chǎn)生的凝血酶絕大部分都被TM包圍或分隔 ? 減少凝血酶的生成------大量激活蛋白C（APC）的形成使Ⅴa和Ⅷa水解加速，抑制凝血酶過多

20、地產(chǎn)生,,? 對纖溶的作用 ? TM－凝血酶復(fù)合物能活化凝血酶激活的纖維蛋白降解抑制物（TAFI）。 ? 單鏈尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）也已被證實是TM－凝血酶 復(fù)合物的附加底物，進一步肯定了TM在纖維蛋白降解過程中具有廣泛 的作用。 ? TAFI與蛋白c競爭性的與TM—凝血酶復(fù)合物結(jié)合，形成了一個分 散的表面。,?TM的其它功能 通

21、過生物學(xué)、結(jié)構(gòu)學(xué)、基因工程分析等研究發(fā)現(xiàn)，TM不需要與PC、TAFI或凝血酶結(jié)合，也能發(fā)揮某些其它的生物功能，但必需通過血凝素樣分子和EGF區(qū)域來介導(dǎo)。 ?抗腫瘤、抗炎癥、穩(wěn)定胚胎發(fā)育過程等,Platelets,Inflammatory cells,IIa,Va,VIIIa,Fibrinmonomer,X,Xa,,,,,,,,,Cellular,,,TNFaIL1β,,,,,X,X,X,Quiescence,TF-V

22、lla,X,,*Inactivation,Inactivation,,,,AT,GAG,Endothelium,TM-IIa,,,Protein S,Prot C,APC,,Inactivation,,,,,X,,X,X,Vascular/proteins Fibrinogen,,Fibrinolysis,,,,Restoration of Capillary blood flow,PAI-1,,,X,Protein Z,ZPI

23、,Ischemia/infarction,Site,,,TPI,,,,,,,TM基因多態(tài)性與人類疾病 ●TM基因多態(tài)性與血栓和動脈硬化的關(guān)系 －133C/A多態(tài)性-----心肌梗死（MI） － 33G/A多態(tài)性-----MI或頸動脈硬化 A25T多態(tài)性-----使MI的危險性提高 EGF6區(qū)Ala455Val多態(tài)性----與MI相關(guān) ● TM基因多態(tài)性與TM的功能

24、Arg385Ser多態(tài)性（ EGF 4區(qū)）----使TM的表達和TM的輔因子活 性減少 EGF 4區(qū)和5區(qū)域環(huán)間的突變----使TM的抗凝輔因子活性減低甚至完 全喪失 del791-

25、801,Arg246----第一個導(dǎo)致人類TM功能完全喪失的基因 突變，與血漿TM濃度的減少（大約為正常人的50％）,,TM和血栓疾病 ●老鼠服用TM 減輕凝血酶誘導(dǎo)的血栓栓塞 （依賴TM） 注

26、射抑制PC活化的抗體 加強凝血酶的效果 ●三種不同程度的TM功能缺陷的小鼠 完全TM缺陷的小鼠由于胎盤發(fā)育缺陷而死于宮內(nèi) 表達50%TM功能的小鼠不會引起小鼠自發(fā)性血栓形成，但會增加肺內(nèi)纖維蛋白的形成而導(dǎo)致持續(xù)性的低氧癥,,,TM功能下降 導(dǎo)致血栓形成,,,●TMPro mice

27、（Glu387Pro 點突變基因小鼠） 盡管TM激活PC的能力喪失，但只是輕度增加血栓形成的危險性 TM與其它附加的危險因素結(jié)合才可能參與或?qū)е卵ㄐ纬伞駜?nèi)皮細胞損傷時，局部TM缺乏觸發(fā)了凝血和血栓形成 讓野生型胚胎和TM完全缺陷的胚胎干細胞進行雜交，生產(chǎn)出的鼠的血管內(nèi)皮上有一不連續(xù)的表面，由TM完全缺陷的區(qū)域和鄰近的TM正常表達的區(qū)域相互交替形成的血管內(nèi)皮上，纖維蛋白沉

28、積僅僅出現(xiàn)在TM缺陷的地方。 ● 內(nèi)皮細胞中敲除TM基因 敲除TM基因后不會影響胚胎發(fā)育，但活產(chǎn)的動物由于在動脈和靜脈自發(fā)性血栓形成而導(dǎo)致多臟器損害，出生后短期內(nèi)死于消耗性凝血病。,TM和動脈硬化● 在動脈硬化損害區(qū)，內(nèi)皮上TM的局部缺失導(dǎo)致病變部位PC活化受損 血漿TM的基礎(chǔ)水平能夠反映內(nèi)皮細胞TM表達，但它與動脈硬化疾病之間的關(guān)系不肯定 局部TM的增加是

29、否對動脈硬化有保護作用不肯定,,● 在血管再狹窄和靜脈移植發(fā)生粥樣硬化過程中，TM對局部血管壁的病理改變可能起調(diào)節(jié)作用 將逆轉(zhuǎn)錄病毒的TM注入人為擴張的兔股動脈，可減少血栓負荷、血管壁膜再形成、炎癥細胞的浸潤和基質(zhì)的退化，說明平滑肌細胞增殖受抑與TM有關(guān) 在內(nèi)皮細胞中發(fā)現(xiàn)TM可通過MAP激酶/ERK途徑調(diào)節(jié)依賴凝血酶受體的胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo),TM和中風(fēng) ●有研究表明

30、腦出血與血漿TM水平呈負相關(guān) ●與其他血管床比較，TM在腦毛細血管的表達很低，可能是因為腦內(nèi)某些區(qū)域缺乏TM。 ●體外試驗中腦血管TM的表達可被星型細胞釋放的TGFβ（轉(zhuǎn)化生長因子）抑制，提示TM可能影響星型細胞的功能，從而防止凝血酶誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞死亡。 ●動物研究顯示用可溶性TM治療可極大地改善脊髓損傷的預(yù)后,,TM目前研究狀況●TM作為內(nèi)皮損傷指標的證據(jù) TM與DIC TM、VWF、TF