疊氮基修飾的大鼠血栓調節(jié)蛋白的表達及活性測定.pdf

1、目的：
　　 氨基酸決定了蛋白質自身的結構和活性,通過對一些天然氨基酸的化學修飾,將獨特的化學基團引入蛋白,對于蛋白功能及活性具有很大影響。血栓調節(jié)蛋白
　　 (thrombomodulin,TM)對血栓性疾病的診斷和治療有著重要意義,將化學性質活潑的疊氮基團引入TM,可以進一步的發(fā)揮其優(yōu)勢作用。本實驗旨在以pET-28a(+)質粒為表達載體,構建含有重組質粒的E.coliB834(DE3)菌株,誘導表達疊氮基修飾的大鼠

2、血栓調節(jié)蛋白,并對其進行純化和活性測定。
　　 方法：
　　 1、蛋氨酸類似物2-氨基-4-疊氮丁酸(AHA)合成
　　 首先以L-蛋氨酸為起始原料經(jīng)硫甲基化、水解合成L-2-氨基-4-羥基丁酸,然后經(jīng)溴代開環(huán)、成酯、疊氮化、水解四步反應得到目標產(chǎn)物。經(jīng)純化重結晶、干燥后,室溫密封待用。
　　 2、質粒的提取及轉化
　　 復蘇菌株E.coliBL21(DE3),提取質粒,并測序鑒定其DNA序列,將

3、測序正確的質粒轉化E.coliB834(DE3)感受態(tài)細胞。
　　 3、含有AHA的融合蛋白的誘導表達
　　 將轉化成功的B834(DE3)陽性菌落接于3mlLB液體培養(yǎng)基,37℃振搖過夜,1%接種到100mlM9-20液體培養(yǎng)基中,37℃振搖過夜,4000r/min,5min,棄上清,菌體加入30mlM9-AHA液體培養(yǎng)基懸浮,4000r/min,5min,棄上清,菌體再以50mlM9-AHA重懸,3h至A600為0.

4、5,加IPTG至終濃度為0.5mmol/L。30℃誘導5h,分別于1h,2h,3h,4h,5h取樣,用凝膠濃度為10%的SDS-PAGE檢測,考馬斯亮藍R250染色,同時以含空載pET-28a(+)質粒的E.coliBL21(DE3)及空宿主菌作為對照。
　　 4、融合蛋白的純化
　　 將融合蛋白樣品超聲破碎后離心取上清通過0.45μm微孔濾膜,以0.4ml/min流速過柱。用PBS沖洗10min,流速為1.0ml/mi

5、n,再用含有10mmol/L的GSH洗脫液洗脫融合蛋白,流速為1.0ml/min,洗脫10min。收集洗脫液于離心管中,于凝膠濃度為10%的SDS-PAGE檢測。
　　 5、融合蛋白的活性測定
　　 取30份新鮮的大鼠血漿,每份100μl,加入部分凝血活酶100μl,分別加入按100%、75%、50%、25%、0%稀釋的融合蛋白溶液,37℃預熱5min,然后加入CaCl2溶液100μl,加入的同時開始計時,記錄血漿凝固時

6、間,并以同樣稀釋度的標簽蛋白溶液作為對照。重復3組上述操作。
　　 結果：
　　 1、AHA的合成
　　 淡黃色粉末,收率:90.2%,[α]20D=+0.42(c0.8,CH3OH)。IR(KBr,cm-1):3310、2096、1591、1390、1100。1HNMR(300MHz,D20)6:3.41(t,2H,J=7.4Hz)、2.96(m,1H)、1.89(m,2H)。
　　 光譜數(shù)據(jù)與結構相符

7、。
　　 2、質粒的提取及轉化
　　 質粒提取并轉化后,涂布平板,有陽性白色菌落長出,質粒構建成功。
　　 3、融合蛋白的表達及純化
　　 經(jīng)SDS-PAGE分析,重組菌所在泳道有相對分子質量約為47000的融合蛋白表達,在溫度為30℃條件下,IPTG濃度為0.5mmol/L,誘導4h時,融合蛋白的誘導表達量最高。利用GSTrapFF蛋白純化預裝柱得到了純凈的融合蛋白溶液。
　　 4、蛋白的活性測

8、定
　　 以稀釋度為橫坐標,以3組重組質粒和空載質粒,對應凝血時間的平均值為縱坐標構建坐標圖。利用SPSS統(tǒng)計軟件,重組質粒的凝血時間與稀釋度經(jīng)直線回歸分析有統(tǒng)計相關性(r=0.955,p＜0.05),而空載質粒的凝血時間與稀釋度無統(tǒng)計相關性(r=-0.680,p＞0.05)?？寺”磉_的TM融合蛋白是具有生物活性的。
　　 結論：
　　 合成了蛋氨酸類似物-2-氨基-4-疊氮丁酸(AHA),其結構經(jīng)IR、NMR確