Exendin-4衍生物的制備、修飾及活性測(cè)定.pdf

1、Exendin-4是由美洲希拉毒蜥(Heloderma suspectum)唾液腺分泌的39個(gè)氨基酸組成的多肽，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)通過(guò)與胰高血糖素樣肽-1(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)的受體結(jié)合發(fā)揮作用，是GLP-1受體的激動(dòng)劑。Exendin-4與GLP-1受體結(jié)合后，可在機(jī)體血糖濃度過(guò)高時(shí)促進(jìn)胰島素分泌，進(jìn)而有效降低血糖濃度；在血糖較低時(shí)則無(wú)此作用，故不會(huì)引起低血糖。此外，Exendin-4還可增強(qiáng)胰島素的

2、敏感性，抑制β-細(xì)胞凋亡、促進(jìn)β-細(xì)胞新生、刺激β-細(xì)胞增殖，而且Exendin-4自身有著較強(qiáng)的穩(wěn)定性，可抵抗機(jī)體內(nèi)二肽基肽酶Ⅳ的降解。這些特性使得Exendin-_4在Ⅱ型糖尿病治療藥物開(kāi)發(fā)方面有著廣闊的前景。本研究在Exendin-4序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了一種新的Exendin-4衍生物(E306)序列，并通過(guò)基因工程方法制備得到E306多肽。動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)活性后，再利用Biotin-NHS對(duì)E306的賴(lài)氨酸進(jìn)行修飾，使其適于口服用藥

3、。
　　 研究?jī)?nèi)容及結(jié)果包括以下3部分：
　　 1、E306多肽的克隆、表達(dá)及純化根據(jù)Exendin-4的構(gòu)效關(guān)系，以Exendin-4前30個(gè)氨基酸序列Exendin-4(1-30)為出發(fā)點(diǎn)，在其末尾添加6個(gè)賴(lài)氨酸，設(shè)計(jì)出E306序列。設(shè)計(jì)PCR引物，在下游引物中加入6個(gè)賴(lài)氨酸對(duì)應(yīng)堿基。以含有Exendin-4(1-30)基因序列的質(zhì)粒pET-32a(+)-E30為模板，通過(guò)PCR得到E306基因。將E306基因克隆到

4、載體pET-32a(+)中，構(gòu)建得到重組表達(dá)載體pET-32a(+)-E306，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)獲得基因工程表達(dá)菌株pET-32aq(+)-E306/BL21(DE3)。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，在相對(duì)分子量為21 kDa處出現(xiàn)目的融合蛋白表達(dá)條帶，表達(dá)形式為可溶性表達(dá)，表達(dá)量為22.72％。通過(guò)親和層析得到融合蛋白，經(jīng)腸激酶酶切和二次親和層析，最終得到電泳純的E306多肽，計(jì)算所得E306多肽的產(chǎn)量為0.64mg/g菌體。
　　

5、 2、E306多肽的性質(zhì)研究向健康昆明小鼠腹腔注射E306多肽，糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，E306多肽可顯著改善小鼠對(duì)葡萄糖的耐受性，降低因注射葡萄糖造成的血糖濃度升高，2 h內(nèi)的平均血糖值低于對(duì)照組41％(P<0.001)。在糖尿病模型鼠(db/db鼠)中檢測(cè)E306多肽的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E306同樣可顯著改善db/db鼠對(duì)葡萄糖的耐受性，2 h內(nèi)的平均血糖值低于對(duì)照組48％(P<0.001)。在健康昆明小鼠體內(nèi)測(cè)定腹腔注射E306多肽的降

6、血糖持續(xù)時(shí)間，結(jié)果測(cè)得1 nmol/kg的劑量下，E306多肽的降糖持續(xù)時(shí)間可達(dá)6 h。E306多肽在昆明鼠體內(nèi)的降糖持續(xù)時(shí)間隨著劑量的增加而有所延長(zhǎng)，當(dāng)劑量由0.1 nmol/kg上升到10 nmol/kg時(shí)，對(duì)應(yīng)降糖持續(xù)時(shí)間由1 h延長(zhǎng)至7 h。
　　 利用圓二色譜測(cè)定了E306多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，得到E306多肽各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成及含量為：α-螺旋(68.8％)，β-轉(zhuǎn)角(1.9％)，無(wú)規(guī)卷曲(29.3％)；同等條件下對(duì)E30

7、多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定，得到其二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成及含量為：α-螺旋(39.8％)，β-轉(zhuǎn)角(7.4％)，無(wú)規(guī)卷曲(52.8％)。E306多肽比E30多肽的α-螺旋含量增加了29％，添加的6個(gè)賴(lài)氨酸增加了E306多肽的α-螺旋含量。
　　 3、E306多肽的Biotin-NHS修飾及修飾產(chǎn)物活性研究將E306多肽與Biotin-NHS以物質(zhì)的量之比為1:8混合，室溫反應(yīng)1 h，Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和HPLC分析結(jié)

8、果顯示，Biotin-NHS結(jié)合到了E306多肽分子上。將修飾產(chǎn)物、單獨(dú)的E306多肽以300 nmol/kg的劑量分別通過(guò)口服方式給予健康小鼠，糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：給予修飾產(chǎn)物組的小鼠對(duì)葡萄糖的耐受性有了顯著改善，兩組小鼠在1 h內(nèi)的平均血糖值分別低于對(duì)照組38％(P<0.01)、21％(P>0.05)。
　　 綜上，本研究構(gòu)建了表達(dá)載體pET-32a(+)-E306，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)得到基因工程菌pET-32a