南瓜蛋白的原核表達(dá)及生物學(xué)活性測定.pdf

1、目的：從南瓜果肉中提取南瓜蛋白過程繁瑣，周期較長，且提取的南瓜蛋白在動物體內(nèi)免疫原性較強(qiáng)。為解決上述一系列問題，基于南瓜蛋白的基因組成已知，可用原核表達(dá)系統(tǒng)制備，其操作簡單，周期較短，耗材少。此種制備南瓜蛋白方法的建立不僅可以為制備活性更高但體內(nèi)免疫原性更低的南瓜蛋白突變體奠定了基礎(chǔ)，也可以對南瓜蛋白基因定點(diǎn)突變或增加半胱氨酸為抗體交聯(lián)提供一種新的方法。
　　方法：將含重組南瓜蛋白基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，篩選陽

2、性菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，用IPTG低溫誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，通過SDS-PAGE鑒定其表達(dá)形式；用鎳柱親和層析法分離純化可溶性重組蛋白，用離子交換柱進(jìn)一步純化目的蛋白；用SRB法和MTT法檢測其對部分體外腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用；將rCUS免疫BALB/C小鼠去眼球取血通過間接ELISA測其對小鼠的免疫原性。
　　結(jié)果：重組蛋白大部分以包涵體形式表達(dá)，少部分以可溶性形式表達(dá)，嘗試多種復(fù)性方法對包涵體復(fù)性，但復(fù)性效率太低或者復(fù)性后穩(wěn)定性差或者

3、體外藥理活性不高，故通過鎳柱親和層析法獲得可溶性表達(dá)產(chǎn)物，用離子交換柱純化后可得到純度在95％的重組蛋白，其對體外胰腺癌細(xì)胞PANC-1、胃癌細(xì)胞SGC-7901、淋巴癌細(xì)胞 Raji、白血病細(xì)胞 HL-60的IC50值分別為（6.0564±0.0014）μg/ml、（4.7697±0.0014）μg/ml、（9.9811±0.0018）μg/ml、（4.9640±0.0018）μg/ml。間接ELISA法測其對BALB/C小鼠的抗體滴