煙草中焦油與尼古丁對(duì)血栓調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)和血栓調(diào)節(jié)蛋白與凝血酶相互作用的影響及瑞舒伐他汀的干預(yù).pdf

1、吸煙是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在臨床實(shí)踐及以往文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)吸煙可以導(dǎo)致血管內(nèi)血栓形成，引起急性心肌梗死的發(fā)生。但其機(jī)制目前并不清楚。內(nèi)皮細(xì)胞在維持血流通暢、抵抗血栓形成等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。血栓調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin，TM）是內(nèi)皮細(xì)胞表面具有很強(qiáng)抗凝活性的蛋白，它主要通過與凝血酶1∶1的高親和力結(jié)合，激活蛋白C發(fā)揮抗凝作用。這一抗凝過程不但受TM表達(dá)量的影響，同時(shí)也受其與凝血酶相互作用的影響。目前體外觀察吸煙對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞

2、TM表達(dá)的研究較少，焦油、尼古丁作為煙草中兩種重要的有害物質(zhì)，被人們廣泛研究，但罕見報(bào)道其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞TM表達(dá)的影響。瑞舒伐他汀作為新一代的降脂藥，不僅具有調(diào)節(jié)血脂的功能，還具有抗炎，抗血栓，改善血管內(nèi)皮功能，穩(wěn)定斑塊等作用。但瑞舒伐他汀是否改善焦油與尼古丁對(duì)TM的表達(dá)并不清楚。另外，關(guān)于TM與凝血酶相互作用的研究，原子力顯微鏡(atomic forcemicroscopy，AFM)單分子力譜(single-molecule force

3、spectroscopy，SMFS)以其pN級(jí)的高分辨率實(shí)現(xiàn)了在活細(xì)胞表面單分子水平作用力的測(cè)定而具有獨(dú)特的優(yōu)越性。雖然近年來采用原子力顯微鏡對(duì)于生物分子間相互作用的研究越來越多，并不斷獲得新的進(jìn)展，但是關(guān)于焦油與尼古丁對(duì)TM/凝血酶單分子間的相互作用及瑞舒伐他汀的干預(yù)的研究未見報(bào)道。
　　第一部分焦油與尼古丁對(duì)血栓調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的影響
　　目的:研究不同條件下焦油與尼古丁對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilical ve

4、in endothelial cells，HUVECs)的增殖影響及表面TM表達(dá)的影響，從而探討吸煙導(dǎo)致血管內(nèi)血栓形成的可能機(jī)制。
　　方法:以0.1％Ⅰ型膠原酶消化人臍靜脈內(nèi)皮37℃15-20min，分離獲得原代HUVECs，在37℃、5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)至融合后傳代，用Ⅷ因子相關(guān)抗原鑒定HUVECs，2-3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　1、CCK-8法檢測(cè)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs增殖的影響
　　將HUVECs接種于96孔

5、板，用不同濃度焦油（50mg/L，20 mg/L，10 mg/L,1 mg/L)、尼古?。?0-3mol/L,10-5mol/L,10-7mol/L,10-9mol/L)不同時(shí)間(6h、24h)孵育細(xì)胞。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10ul CCK-8溶液37℃，5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)1-4h，酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度A值。
　　2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs表面TM蛋白表達(dá)的影響
　　將HUVECs接種于6孔板，

6、用不同濃度焦油(50mg/L、20mg/L、10mg/L、1mg/L)、尼古丁(10-3mol/L,10-5mol/L,10-7mol/L,10-9mol/L)同一時(shí)間(6h)及同一濃度20mg/L焦油、10-5mol/L尼古丁不同時(shí)間(0h、1h、6h、12h、24h)孵育細(xì)胞。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)每組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度，檢測(cè)TM蛋白表達(dá)，每次計(jì)數(shù)30000個(gè)細(xì)胞。
　　3、熒光定量PCR檢測(cè)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs表面TM mRNA表

7、達(dá)的影響
　　將HUVECs接種于6孔板，用不同濃度焦油(50mg/L、20mg/L、10mg/L、1mg/L)、尼古丁(10-3mol/L,10-5mol/L,10-7mol/L,10-9mol/L)同一時(shí)間(6h)及同一濃度20mg/L焦油、10-5mol/L尼古丁不同時(shí)間(0h、1h、6h、12h、24h)孵育細(xì)胞。熒光定量PCR檢測(cè)TM mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、CCK-8法檢測(cè)焦油與尼古丁對(duì)HUVE

8、Cs增殖的影響
　　與對(duì)照組相比，不同濃度焦油6h、24h組均可觀察到隨濃度的升高，A值逐漸降低的趨勢(shì)，但只有50mg/L焦油6h、24h組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。而不同濃度尼古丁6h、24h組與對(duì)照組相比可觀察到隨濃度的升高，A值逐漸升高的趨勢(shì)，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs表面TM蛋白表達(dá)的影響
　　與對(duì)照組相比，不同濃度焦油組可以觀察到隨著焦油濃度的升高TM蛋白表達(dá)逐漸

9、增加，呈濃度依賴性，而且10mg/L焦油組即可達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。與0h相比，不同時(shí)間焦油組也可觀察到隨著時(shí)間的延長(zhǎng)TM蛋白表達(dá)逐漸增加，呈時(shí)間依賴性，而且6h即可達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。并且觀察到6h內(nèi)焦油組TM蛋白表達(dá)量增加最快，而隨時(shí)間延長(zhǎng)，TM蛋白表達(dá)量增加速率則逐漸減慢。尼古丁組隨濃度、時(shí)間變化均對(duì)HUVECs表面TM蛋白表達(dá)無影響。
　　3、熒光定量PCR檢測(cè)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs表面TM mRNA

10、表達(dá)的影響
　　與對(duì)照組相比，不同濃度焦油組可以觀察到隨著焦油濃度的升高TMmRNA表達(dá)逐漸增加，呈濃度依賴性，而且1mg/L焦油組即可達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。與0h相比，不同時(shí)間焦油組也可觀察到隨著時(shí)間的延長(zhǎng)TM mRNA表達(dá)逐漸增加，呈時(shí)間依賴性，而且1h即可達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。并且觀察到6h內(nèi)焦油組TM mRNA表達(dá)量增加最快，而隨時(shí)間延長(zhǎng)，TM mRNA表達(dá)量增加速率則逐漸減慢。尼古丁組隨濃度、時(shí)間變化均對(duì)

11、HUVECs表面TM mRNA表達(dá)無影響。
　　結(jié)論:
　　1、焦油抑制HUVECs的增殖。尼古丁具有增強(qiáng)HUVECs增殖的趨勢(shì)。
　　2、焦油增加HUVECs表面TM的表達(dá)，呈濃度、時(shí)間依賴性。尼古丁對(duì)HUVECs表面TM的表達(dá)無影響。
　　第二部分瑞舒伐他汀干預(yù)焦油與尼古丁對(duì)血栓調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)及活性的影響
　　目的:研究瑞舒伐他汀干預(yù)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs的增殖影響及表面TM表達(dá)及活性的影響，從而探討

12、他汀類藥物改善吸煙致血管內(nèi)血栓形成的可能機(jī)制。
　　方法:以0.1％Ⅰ型膠原酶消化人臍靜脈內(nèi)皮37℃15-20min，分離獲得原代HUVECs，在37℃、5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)至融合后傳代，第2-3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　1、CCK-8法檢測(cè)瑞舒伐他汀干預(yù)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs增殖的影響
　　將HUVECs接種于96孔板，用50mg/L焦油、10-3mol/L尼古丁、50mg/L焦油+50umol/L他汀，10-3mo

13、l/L尼古丁+50umol/L他汀，50umol/L他汀不同時(shí)間(6h、24h)孵育細(xì)胞。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10ul CCK-8溶液37。C，5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)1-4h，酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度A值。
　　2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)瑞舒伐他汀干預(yù)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs表面TM蛋白表達(dá)的影響
　　將HUVECs接種于6孔板，用20mg/L焦油、10-5mol/L尼古丁、20mg/L焦油+50umol/L他汀，10-5mo

14、l/L尼古丁+50umol/L他汀，50umol/L他汀孵育細(xì)胞。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)每組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度，檢測(cè)TM蛋白表達(dá)，每次計(jì)數(shù)30000個(gè)細(xì)胞。
　　3、熒光定量PCR檢測(cè)瑞舒伐他汀干預(yù)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs表面TM mRNA表達(dá)的影響
　　將HUVECs接種于6孔板，用20mg/L焦油、10-5mol/L尼古丁、20 mg/L焦油+50umol/L他汀，10-5mol/L尼古丁+50umol/L他汀，50umol/L他

15、汀孵育細(xì)胞。熒光定量PCR檢測(cè)TM mRNA表達(dá)。
　　4 TM活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs表面TM活性的影響及瑞舒伐他汀的干預(yù)
　　將HUVECs接種于96孔板，用20mg/L焦油、10-5mol/L尼古丁、20mg/L焦油+50umol/L他汀，10-5mol/L尼古丁+50umol/L他汀，50umol/L他汀不同時(shí)間(6h、24h)孵育細(xì)胞。酶標(biāo)儀405nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度A值。
　　結(jié)果:
　　

16、1、CCK-8法檢測(cè)瑞舒伐他汀干預(yù)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs增殖的影響
　　與50mg/L焦油組相比，他汀+焦油組可增加吸光度A值(P＜0.05);但與對(duì)照組相比，他汀組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。他汀+尼古丁組與尼古丁組也無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)瑞舒伐他汀干預(yù)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs表面TM蛋白表達(dá)的影響
　　與對(duì)照組相比，他汀組可增加HUVECs表面TM蛋白表達(dá)(P＜0.05);與焦油組相比，他汀+焦油組

17、可增加HUVECs表面TM蛋白表達(dá)(P＜0.05);與尼古丁組相比，他汀+尼古丁組可增加HUVECs表面TM蛋白表達(dá)（P＜0.05）。
　　3、熒光定量PCR檢測(cè)瑞舒伐他汀干預(yù)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs表面TM mRNA表達(dá)的影響
　　與對(duì)照組相比，他汀組可增加HUVECs表面TM mRNA表達(dá)(P＜0.05);與焦油組相比，他汀+焦油組可增加HUVECs表面TM mRNA表達(dá)(P＜0.05);與尼古丁組相比，他汀+尼古丁組

18、可增加HUVECs表面TM mRNA表達(dá)(P＜0.05)。
　　4、TM活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs表面TM活性的影響及瑞舒伐他汀的干預(yù)
　　與對(duì)照組相比，焦油組降低吸光度A值，降低TM的活性(P＜0.05);與焦油組相比，他汀+焦油組可增加吸光度A值（P＜0.05）;而尼古丁組與對(duì)照組相比吸光度A值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，他汀+尼古丁組及他汀組與對(duì)照組相比可增加吸光度A值(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、

19、瑞舒伐他汀能改善焦油抑制的HUVECs增殖，但本身對(duì)HUVECs的增殖無影響。
　　2、瑞舒伐他汀可增加HUVECs表面TM的表達(dá)，并在焦油增加TM表達(dá)的基礎(chǔ)上，仍能再次上調(diào)TM的表達(dá)。
　　3、焦油降低TM活性，瑞舒伐他汀可改善這一效應(yīng)，并且瑞舒伐他汀本身也可增加TM的活性。尼古丁對(duì)TM活性無影響。
　　第三部分單分子力譜檢測(cè)焦油與尼古丁對(duì)血栓調(diào)節(jié)蛋白與凝血酶相互作用的影響及瑞舒伐他汀的干預(yù)
　　目的:利用單分

20、子力譜法檢測(cè)焦油與尼古丁對(duì)TM與凝血酶單分子水平相互作用及瑞舒伐他汀的干預(yù)，從而探討吸煙導(dǎo)致血管內(nèi)血栓形成及他汀類藥物抗血栓作用的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1、pTM-GFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞及AFM分組測(cè)力
　　實(shí)驗(yàn)分組:1）空白對(duì)照組（無質(zhì)粒轉(zhuǎn)染）;2）對(duì)照組（質(zhì)粒轉(zhuǎn)染）;3)50mg/L焦油孵育轉(zhuǎn)染細(xì)胞1h組（焦油組）;4）10-3mol/L尼古丁孵育轉(zhuǎn)染細(xì)胞1h組（尼古丁組）;5）50umol/L瑞舒

21、伐他汀+50mg/L焦油孵育轉(zhuǎn)染細(xì)胞1h組（他汀+焦油組）;6）50umol/L瑞舒伐他汀+10-3mol/L尼古丁孵育轉(zhuǎn)染細(xì)胞1h組（他汀+尼古丁組）;7）50umol/L瑞舒伐他汀孵育轉(zhuǎn)染細(xì)胞1h組（他汀組）。采用AFM及熒光倒置顯微鏡聯(lián)用系統(tǒng)，在熒光倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞表達(dá)的TM熒光融合蛋白聚集區(qū)，用凝血酶修飾的AFM探針反復(fù)隨機(jī)的在細(xì)胞表面蛋白聚集區(qū)下壓-回拉，獲得力-距離曲線，統(tǒng)計(jì)得出TM與凝血酶間結(jié)合力的高斯分布及成鍵幾

22、率。
　　2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)焦油、尼古丁和瑞舒伐他汀對(duì)COS-7細(xì)胞表面TM熒光蛋白表達(dá)的影響
　　將轉(zhuǎn)染后的COS-7細(xì)胞接種于6孔板，用50mg/L焦油、10-3mol/L尼古丁、50mg/L焦油+50umol/L他汀，10-3mol/L尼古丁+50umol/L他汀，50umol/L他汀孵育細(xì)胞1h。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)每組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度，檢測(cè)TM蛋白表達(dá)，每次計(jì)數(shù)30000個(gè)細(xì)胞。
　　結(jié)果:
　　1、AFM檢測(cè)

23、焦油與尼古丁對(duì)TM與凝血酶之間的相互作用及瑞舒伐他汀的干預(yù)
　　與對(duì)照組相比，焦油組可明顯降低TM與凝血酶間結(jié)合幾率(P＜0.05)，所得結(jié)合幾率低至＜5％，可視為分子間結(jié)合極低或無結(jié)合，無法計(jì)算TM與凝血酶間的分子結(jié)合力;與焦油組相比，他汀+焦油組可明顯增加TM與凝血酶間結(jié)合幾率(P＜0.05)，達(dá)到與對(duì)照組相當(dāng)?shù)乃?，并且?jì)算得出的他汀+焦油組的分子結(jié)合力明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。而尼古丁組與對(duì)照組相比在結(jié)合幾率和結(jié)合力

24、上均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;他汀+尼古丁組與尼古丁組相比結(jié)合幾率雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是結(jié)合力卻明顯增加（P＜0.05）;他汀組與對(duì)照組相比結(jié)合幾率也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但結(jié)合力明顯增加（P＜0.05）。
　　2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)焦油與尼古丁對(duì)COS-7細(xì)胞表面TM熒光蛋白表達(dá)的影響及瑞舒伐他汀的干預(yù)
　　與對(duì)照組相比，焦油組與他汀+焦油組可明顯增加COS-7細(xì)胞表面TM表達(dá)（P＜0.05）;尼古丁組、他汀組及尼古丁+他汀組與對(duì)照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)