殺菌-通透性增加蛋白（BPI）mRNA表達(dá)水平的初步研究及人BPI活性片段基因的克隆.pdf

1、殺菌/通透性增加蛋白(Bactericidal/permeability-increasingprotein，BPI)是哺乳動(dòng)物中性粒細(xì)胞中存在的一種堿性蛋白，它能與革蘭氏陰性菌脂多糖結(jié)合，增加外膜對(duì)抗菌藥物的通透性，具有中和內(nèi)毒素和殺滅細(xì)菌的生物學(xué)作用，在革蘭氏陰性菌感染的治療方面有良好的發(fā)展前景。 本研究分為兩部分：第一部分采用巢式RT-PCR技術(shù)，對(duì)22例慢性支氣管炎患者入院時(shí)及使用阿奇霉素氯化鈉注射液7天后的外周血中BP

2、ImRNA含量進(jìn)行半定量檢測(cè)，考察感染患者使用阿奇霉素后對(duì)BPImRNA表達(dá)水平的影響，分析BPI在炎癥過程中的動(dòng)態(tài)變化。第二部分從人外周血多形核白細(xì)胞中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出編碼BPI N端活性部位199個(gè)氨基酸的基因片段(BPI<,597>)，并將其克隆入pBS-T載體，為下一步的研究奠定基礎(chǔ)。 第一部分：殺菌/通透性增加蛋白(BPI)mRNA表達(dá)水平的研究方法： 選取22例慢性支氣管炎患者為實(shí)驗(yàn)組，1

3、8例健康體檢者為對(duì)照組，選擇病原菌均為肺炎球菌的患者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)患者應(yīng)用阿奇霉素治療。對(duì)照組性別、年齡均與實(shí)驗(yàn)組相匹配。健康體檢者及感染患者分別于入院當(dāng)天和治療7±2天后采集EDTA-K<,2>抗凝血6ml。其中l(wèi)ml用于血常規(guī)檢測(cè)，5ml用于提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增出BPIcDNA特異性片段。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后半定量分析：目標(biāo)基因光密度值與內(nèi)參光密度值的比值代表外周血中BPImRNA表達(dá)量的相對(duì)多少。數(shù)據(jù)

4、以x±s表示，結(jié)果應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。 結(jié)果 1．總RNA提取產(chǎn)物的鑒定對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組總RNA的OD<,260nm>．JOD<,280nm>比值，結(jié)果均大于1．8，表明所提總RNA具有較高的純度。 提取的對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組總RNA經(jīng)1﹪瓊脂糖凝膠電泳，可見明顯的28s，18s和5s條帶，表明所提取的總RNA有較好的完整性，符合逆轉(zhuǎn)錄要求。 2 BP

5、ImRNA目的基因片段RT-PCR結(jié)果取各組擴(kuò)增產(chǎn)物于2﹪瓊脂糖凝膠中80V電泳45min，紫外下觀察可見：400bp附近處條帶為BPImRNA基因片段，300bp附近處條帶為內(nèi)參β-actin基因片段。 3 BPImRNA表達(dá)水平的結(jié)果及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析18例健康受試者外周血中BPImRNA的平均相對(duì)表達(dá)水平為0．74±0．40；22例慢性支氣管炎患者入院時(shí)以及治療后，外周血中BPImRNA的平均相對(duì)表達(dá)水平分別為0．46±0．2

6、3和0．24±0．19。通過兩樣本間t檢驗(yàn)以及配對(duì)t檢驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，慢性支氣管炎患者外周血中BPImRNA的平均相對(duì)表達(dá)水平明顯低于正常健康對(duì)照組，且其使用阿奇霉素氯化鈉注射液治療后，表達(dá)水平更低。說明隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，BPI控制感染的能力逐漸降低，BPI質(zhì)量或數(shù)量上缺失的病人容易遭受微生物或感染的入侵。 方法： EDTA-K<,2>抗凝管采集健康人外周血5ml，分

7、離多形核白細(xì)胞并用生理鹽水稀釋至5×10<'7>個(gè)/ml，-70℃保存用于提取總RNA。Trizol法抽提全血總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增獲得目的基因，瓊脂糖凝膠電泳后用Qiagen膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pBS-T克隆載體進(jìn)行連接反應(yīng)。將連接體轉(zhuǎn)化入JMl09感受態(tài)細(xì)菌中，重組分子隨受體菌的生長(zhǎng)繁殖復(fù)制擴(kuò)增。挑選白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，從陽(yáng)性克隆菌中提取質(zhì)粒DNA，測(cè)序。 結(jié)果： 1．RT