LfcinB基因的克隆、突變、表達(dá)及抗菌活性的初步研究.pdf

1、目的：優(yōu)化設(shè)計(jì)LfcinB基因，構(gòu)建pGEX-4T-1-LfcinB重組分子；利用PCR技術(shù)對LfcinB基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建pGEX-4T-1-m3’14'LfcinB表達(dá)重組體；將兩種重組體分別在大腸桿菌BL21中融合表達(dá)，測定抗菌活性。 方法：根據(jù)Genebank中LfcinB DNA序列及氨基酸殘基序列，按照Codon Usage Database中大腸桿菌偏愛的密碼子原則對LfcinB基因進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。利用基因重組技

2、術(shù)構(gòu)建克隆重組體pUC-18-LfcinB，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，進(jìn)行酶切、PCR及測序鑒定；構(gòu)建表達(dá)重組體pGEX-4T-1-LfcinB，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，進(jìn)行酶切、PCR及測序鑒定。利用反轉(zhuǎn)PCR法定點(diǎn)突變技術(shù)，采用TaKaRa MutanBEST kit對重組體pGEX-4T-1-LfcinB中LfcinB第3位Cys密碼子TGC、14位Gly密碼子GGT實(shí)施定點(diǎn)突變，均突變?yōu)門ry密碼子TGG。將突變體轉(zhuǎn)化至大腸桿

3、菌BL21中，挑取陽性菌落進(jìn)行酶切、PCR及測序鑒定。將兩種陽性的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化菌用IPTG 37℃誘導(dǎo)表達(dá)，全菌體蛋白SDS-PAGE觀察表達(dá)結(jié)果。用B-PER GSTSpin純化試劑盒純化融合蛋白，SDS-PAGE觀察得到的融合蛋白是否以包涵體形式存在。用凝血酶切割融合蛋白，GST Spin柱純化，抑菌圈實(shí)驗(yàn)初步鑒定LfcinB和m3’14’LfcinB的抗菌活性。 結(jié)果： 1．獲得優(yōu)化的LfcinB DNA片段，大小

4、為94bp；構(gòu)建了克隆重組體PUC-18-LfcinB，經(jīng)酶切、PCR鑒定和測序，結(jié)果表明與預(yù)先設(shè)計(jì)的DNA序列完全一致。 2．構(gòu)建了表達(dá)重組體pGEX-4T-1-LfcinB，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，經(jīng)酶切、PCR鑒定和測序結(jié)果表明LfcinB基因與表達(dá)載體連接方向正確，可以進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。 3．成功實(shí)現(xiàn)了對LfcinB基因的定點(diǎn)突變，獲得突變型表達(dá)重組體pGEX-4T-1-m3’14’LfcinB，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌

5、BL21中，測序結(jié)果表明LfcinB DNA序列中第3位Cys密碼子TGC、第14位Gly密碼子GGT均突變?yōu)門ry密碼子TGG，達(dá)到預(yù)期突變結(jié)果。m3’14’LfcinB基因與融合表達(dá)載體連接方向正確，可以進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。 4．兩種表達(dá)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3～5小時(shí)后，SDS-PAGE電泳結(jié)果可見29KD的融合蛋白條帶。表達(dá)的融合蛋白經(jīng)B-PER GSTSpin純化試劑盒純化后電泳，表明融合蛋白以包涵體形式存在。 5．

6、經(jīng)凝血酶切割分離融合蛋白GST-LfcinB蛋白和GST-m3’14’LfcinB，獲得了LfcinB和m3’14’LfcinB。純化后的兩種蛋白用抑菌圈實(shí)驗(yàn)測定抗菌活性，表現(xiàn)出對金黃色葡萄球菌ATCC25938和大腸桿菌的抗菌作用，而且m3’14’LfcinB抑菌圈直徑大于LfcinB。 結(jié)論：成功構(gòu)建了表達(dá)重組體pGEX-4T-1-LfcinB及突變型表達(dá)重組體pGEX-4T-1-m3’14’LfcinB；成功實(shí)現(xiàn)了在大腸桿