MIP-1α增加腸屏障通透性及其機制的研究.pdf

1、目的：
　　 腸上皮細胞的緊密連接是腸上皮細胞間的主要連接方式，它對維持上皮細胞的極性、調(diào)節(jié)腸屏障的通透性發(fā)揮著重要的作用。緊密連接調(diào)節(jié)著離子和大分子物質(zhì)的跨細胞旁路的被動轉(zhuǎn)運，只允許小分子可溶性物質(zhì)和離子通過而不允許毒性大分子和微生物通過，緊密連接一旦發(fā)生改變，腸上皮細胞(IEC)間隙通透性就會增加，所以上皮細胞的完整性對于保護腸道的屏障功能及防止微生物進入體內(nèi)具有重要的意義，現(xiàn)已證明有多種蛋白質(zhì)參與緊密連接的形成，主要有ZO

2、s、occludin、claudin以及黏附分子等[1-2]。目前認為主要起作用的蛋白為ZO-1、occludin、claudin蛋白。
　　 巨噬細胞炎性蛋白(macrophage inflammatory protein，MIP)-1α是C-C趨化因子家族成員之一，對多種細胞具有趨化、活化作用[3-4]，是參與機體炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的一種重要的趨化性細胞因子，已有研究表明，MIP-1α與很多炎癥性疾病及腫瘤性疾病有密切關(guān)系，

3、但其機制仍不明確。近年也有研究證明，MIP-1α能抑制蛋白的表達[5]。MIP-1α還能抑制細胞進入周期和/或降低細胞的生長速度。
　　 近年研究表明很多因素可以導(dǎo)致腸粘膜屏障通透性的增加，主要是通過緊密連接的改變，本研究旨在加入MIP-1α處理caco-2單層細胞后腸上皮細胞緊密連接的改變情況及其影響機制的闡述。
　　 方法：
　　 1、不同實驗條件下MIP-1α作用于單層caco-2細胞觀察其對緊密連接的影響

4、:
　　 (1)利用Transwell方法觀察不同濃度，相同作用時間、相同濃度不同時間點MIP-1α作用單層caco-2細胞后FITC標記的Dextran透過率的情況。
　　 (2)通過Transwell實驗選取適合濃度及一定作用時間，MIP-1α作用于緊密連接，免疫熒光方法觀察其相關(guān)蛋白ZO-1、occludin的變化情況。
　　 2、通過抑制劑的干擾初步確定相關(guān)的信號通路
　　 (1)分別利用免疫熒光

5、，western-blot，Transwell的實驗方法檢測各種抑制劑預(yù)處理后，50ng/mL MIP-1α與Caco-2細胞相互作用24小時后腸上皮細胞間緊密連接蛋白ZO-1、occludin的變化。
　　 (2)western-blot方法觀察MIP-1α處理后與相關(guān)信號通路相關(guān)的蛋白表達。
　　 結(jié)果：
　　 1、通透性改變
　　 通過Transwell結(jié)合免疫熒光的方法觀察到MIP-1α對單層ca

6、co-2細胞具有增加其通透性的作用。正常Caco-2細胞，occludin及Zo-1蛋白沿細胞膜分布。MIP-1α減少緊密連接蛋白ZO-1的表達，改變occludin蛋白的分布，Zo-1蛋白呈鋸齒狀分布，并且熒光信號減弱;occludin蛋白向胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)移，并且在胞漿內(nèi)可見陽性顆粒。
　　 2、加入抑制劑后與對照組相比
　　 (1)疫熒光可見PD98059、Y27632抑制劑組緊密連接鋸齒狀改變明顯恢復(fù)。LY294002、

7、GO6976抑制劑組未見明顯變化。
　　 (2)Transwell的方法觀察到，F(xiàn)ITC標記的dextran的穿過率，抑制劑LY294002、GO6976實驗組穿過率較對照組未見明顯改變，抑制劑Y27632、PD98059實驗組則明顯降低。
　　 (3) western-blot方法可見緊密連接蛋白ZO-1的表達與對照組相比，GO6976、LY294002實驗組明顯降低或者不升高，Y27632、PD98059實驗組明顯升

8、高。
　　 同時可見occludin蛋白未見明顯變化。Occludin蛋白抽提后，可溶性及不可溶性occludin的表達，可見Y27632、PD98059組可溶性蛋白增加，不可溶性蛋白明顯減少，說明在MIP-1α作用后緊密連接蛋白occludin向胞漿轉(zhuǎn)移。
　　 3、探討MIP-1α處理后幾種信號蛋白的表達情況
　　 western-blot方法檢測到MIP-1α處理后p-cofilin蛋白具有濃度依賴性及時間