內(nèi)皮-單核細(xì)胞激活多肽II增強(qiáng)血腫瘤屏障通透性的機(jī)制.pdf

1、目的：血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)主要由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞組成,內(nèi)皮細(xì)胞之間有緊密連接(tight junction,TJ),BBB不僅能夠保護(hù)腦組織,同時還能阻礙治療性藥物進(jìn)入腦內(nèi)。而主要由供應(yīng)腫瘤的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞所構(gòu)成的血腫瘤屏障(Blood-tumor Barrier,BTB)也具有限制抗腫瘤藥物有效地進(jìn)入腦內(nèi)的特點(diǎn)。因此,選擇性開放BTB成為治療腦膠質(zhì)瘤的重要策略。藥物

2、通過血腫瘤屏障一般有兩種途徑:細(xì)胞旁途徑和跨細(xì)胞途徑。我們的前期研究表明內(nèi)皮-單核細(xì)胞激活多肽Ⅱ(Endothelial Monocyte ActivatingPolypeptide-Ⅱ,EMAP-Ⅱ)能夠通過細(xì)胞旁途徑選擇性地開放BTB,而不影響正常腦組織,但是,關(guān)于EMAP-Ⅱ選擇性開放BTB的具體機(jī)制尚未見報道,有待進(jìn)一步研究。
　　 本研究的目的在于明確EMAP-Ⅱ選擇性開放BTB的作用位點(diǎn)及其通過細(xì)胞旁途徑選擇性開放B

3、TB的可能機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型和體外血腫瘤屏障模型的制備。
　　 2、應(yīng)用伊文思蘭(evans blue,EB)滲透性實驗檢測給予EMAP-Ⅱ作用1h以及α-ATP合成酶抗體預(yù)處理后腦膠質(zhì)瘤大鼠BTB通透性的變化。
　　 3、測量體外BTB模型的跨內(nèi)皮阻抗(transendothelial electric resistance,TEER)值和辣根過氧化物酶(horsera

4、dish peroxidase,HRP)流量,檢測給予EMAP-Ⅱ作用1h以及α-ATP合成酶抗體預(yù)處理后體外BTB通透性的變化。
　　 4、應(yīng)用RT-PCR法檢測給予EMAP-Ⅱ作用1h以及α-ATP合成酶抗體預(yù)處理后,在體BTB模型中緊密連接相關(guān)蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的mRNA表達(dá)水平變化。
　　 5、應(yīng)用Western blot法檢測給予EMAP-Ⅱ作用1h以及α-ATP合成酶抗體預(yù)處理

5、后,在體和體外BTB模型中claudin-5、occludin、ZO-1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化。
　　 6、在體和體外BTB模型中,分別應(yīng)用免疫組織化學(xué)法和免疫熒光法檢測給予EMAP-Ⅱ作用1h以及α-ATP合成酶抗體預(yù)處理后,claudin-5、occludin、ZO-1的分布和表達(dá)水平的變化。
　　 7、在體和體外BTB模型中,應(yīng)用雙重免疫熒光法檢測EMAP-Ⅱ和α-ATP合成酶在腦膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞上的分布。

6、>　　 8、在體外BTB模型中,應(yīng)用蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性實驗檢測EMAP-Ⅱ作用不同時間點(diǎn)時,總的PKC活性的變化。
　　 9、在體外BTB模型中,應(yīng)用Western blot法檢測EMAP-Ⅱ作用不同時間點(diǎn)時,PKC各亞型(α,β,γ,ε,δ,ζ)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化。
　　 10、測量體外BTB的TEER值和HRP流量,檢測給予EMAP-Ⅱ作用1h以及PKC或/和RhoA抑制

7、劑預(yù)處理后體外BTB通透性的變化。
　　 11、應(yīng)用免疫熒光法檢測給予EMAP-Ⅱ作用1h以及PKC或/和RhoA抑制劑預(yù)處理后,體外BTB模型中claudin-5、occludin、ZO-1的分布和表達(dá)水平變化。
　　 12、應(yīng)用Western blot法檢測給予EMAP-Ⅱ作用1h以及PKC或/和RhoA抑制劑預(yù)處理后,體外BTB模型中claudin-5、occludin、ZO-1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化。
　　

8、 13、應(yīng)用Western blot法檢測給予EMAP-Ⅱ作用1h以及PKC或/和RhoA抑制劑預(yù)處理后,體外BTB模型中肌球蛋白輕鏈(MLC)及磷酸化肌球蛋白輕鏈(p-MLC)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、成功地建立了大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型和體外血腫瘤屏障模型。
　　 2、EMAP-Ⅱ作用1h后,大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型的BTB通透性顯著增加;體外BTB模型的TEER值顯著降低,HRP流量顯著增加。

9、在C6腦膠質(zhì)瘤大鼠中,α-ATP合酶抗體預(yù)處理顯著抑制了EMAP-Ⅱ增加BTB通透性的作用;在體外BTB模型中,α-ATP合酶抗體預(yù)處理顯著抑制了EMAP-Ⅱ增加HRP流量的作用,同時抑制了EMAP-Ⅱ降低TEER值的作用。
　　 3、在體和體外BTB模型中,給予EMAP-Ⅱ作用1h后,腦膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞上claudin-5、occludin、ZO-1的表達(dá)顯著減少,其分布由連續(xù)狀念變?yōu)椴贿B續(xù)狀態(tài)。α-ATP合成酶抗體預(yù)處理

10、使claudin-5、occludin、ZO-1在微血管內(nèi)皮細(xì)胞上呈連續(xù)性分布。α-ATP合成酶抗體預(yù)處理顯著抑制了EMAP-Ⅱ降低BMECs中claudin-5、occludin、ZO-1表達(dá)的作用。
　　 4、在體和體外BTB模型中,EMAP-Ⅱ和α-ATP合酶在腦膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上共定位。
　　 5、在體外BTB模型中,BMECs中總PKC活性于EMAP-Ⅱ作用1h時顯著增強(qiáng),隨后逐漸減弱,4h恢復(fù)到未用藥時

11、水平。
　　 6、在體外BTB模型中,EMAP-Ⅱ作用1h時BMECs中PKC-α,β,ζ的蛋白表達(dá)水平顯著增高,隨后逐漸減弱,4h恢復(fù)到未用藥水平。而PKC-γ,ε,δ的蛋白表達(dá)水平無明顯變化。
　　 7、在體外BTB模型中,PKC抑制劑H7和RhoA抑制劑C3 exoenzyme單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用,顯著抑制了EMAP-Ⅱ增加BTB通透性的作用。
　　 8、在體外BTB模型中,PKC抑制劑H7和RhoA抑制劑C3

12、exoenzyme單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用,使claudin-5、occludin、ZO-1在BMECs上呈連續(xù)性分布;同時顯著抑制了EMAP-Ⅱ降低claudin-5、occludin和ZO-1蛋白表達(dá)的作用。
　　 9、在體外BTB模型中,EMAP-Ⅱ作用1h顯著增加p-MLC的蛋白表達(dá)水平,而MLC的蛋白表達(dá)水平未受影響。PKC抑制劑H7和RhoA抑制劑C3exoenzyme單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用,顯著抑制了EMAP-Ⅱ增加p-MLC蛋白表

13、達(dá)的作用。
　　 討論：EMAP-Ⅱ是一種腫瘤起源的前炎癥因子,具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤血管生成的作用。我們近期的在體研究證明EMAP-Ⅱ能通過細(xì)胞旁途徑增加BTB的通透性,卻并不影響正常BBB的通透性。我們本次的在體及體外研究結(jié)果均顯示:EMAP-Ⅱ作用1h后,BTB的通透性顯著增加,TJ相關(guān)蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的表達(dá)顯著降低,有力地支持了我們的前期在體研究結(jié)果,即EMAP-Ⅱ能夠通過開放T

14、J的細(xì)胞旁途徑增加BTB的通透性。
　　 為了確定EMAP-Ⅱ選擇性開放BTB的作用位點(diǎn),我們在應(yīng)用α-ATP合成酶抗體預(yù)處理后,檢測腦膠質(zhì)瘤組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞上claudin-5、occludin、ZO-1的分布和表達(dá)變化。結(jié)果顯示給予α-ATP合成酶抗體預(yù)處理后,EMAP-Ⅱ的上述作用受到顯著抑制。同時,雙重免疫熒光結(jié)果證實了EMAP-Ⅱ與α-ATP合成酶在腫瘤組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面共定位。以上實驗結(jié)果提示腦膠質(zhì)瘤組織微血管

15、內(nèi)皮細(xì)胞膜上的α-ATP合成酶是EMAP-Ⅱ選擇性丌放血腫瘤屏障的可能作用位點(diǎn)。體外研究結(jié)果還顯示:EMAP-Ⅱ作用1h時,微血管內(nèi)皮細(xì)胞的總PKC活性最佳,PKC亞型(α,β,ζ)的蛋白表達(dá)水平顯著增加。給予PKC或RhoA抑制劑預(yù)處理后,EMAP-Ⅱ所致BTB通透性增加、claudin-5、occludin、ZO-1表達(dá)減少的作用受到顯著地抑制,當(dāng)同時給予PKC及RhoA抑制劑預(yù)處理后,EMAP-Ⅱ的上述作用幾乎完全被抑制,說明PK

16、C和RhoA信號分子在EMAP-Ⅱ所介導(dǎo)的BTB通透性增高過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。
　　 結(jié)論：
　　 1、在大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型和體外BTB模型中,EMAP-Ⅱ能通過降低TJ相關(guān)蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的細(xì)胞旁途徑選擇性地增加BTB的通透性。
　　 2、特異性α-ATP合酶抗體預(yù)處理顯著抑制了EMAP-Ⅱ增加BTB通透性的作用,以及EMAP-Ⅱ降低BMECs中claudin-5、o

17、ccludin、ZO-1表達(dá)的作用。
　　 3、腦膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的α-ATP合成酶是EMAP-Ⅱ選擇性增加BTB通透性的作用位點(diǎn)。
　　 4、PKCα、PKCβ和PKCζ在EMAP-Ⅱ發(fā)揮其選擇性增加BTB通透性作用的過程中表達(dá)上調(diào),PKCδ,PKCε和PKγ),的表達(dá)未見變化,提示,PKCα、PKCβ和PKCζ是EMAP-Ⅱ增加BTB通透性過程中的重要信號分子。
　　 5、RhoA-pMLC信號通路參