p38激酶-Caldesmon途徑介導燒傷血清誘導的血管通透性增加及其機制研究.pdf

1、血管通透性增高是燒傷早期體液丟失，引發(fā)休克和早期全身缺氧性損害的根本原因，其本質是血管內皮通透性的增高。由于其機制一直沒有充分闡明，臨床上針對燒傷的治療，尚未找到能降低通透性和減少燒傷輸液的有效措施。相對于穿細胞途徑，內皮細胞旁途徑是燒傷后血管內皮通透性增高的主要途徑。 研究表明，血管通透性變化與調節(jié)涉及細胞骨架重組、粘附連接、緊密連接結構與功能改變等不同的機制。內皮細胞收縮性改變是不同原兇引起通透性增加的共同通路，主要受骨架蛋

2、白中肌球蛋白和肌動蛋白的影響。 p38激酶可能在細胞因子和炎癥介質所致的內皮通透性增高中起著重要的信號轉導作用，p38 MAPK通過磷酸化下游靶蛋白來調節(jié)細胞的功能。目前已發(fā)現(xiàn)p38MAPK有5個異構體，激酶分析顯示p38α是最主要的活性形式，在炎癥反應中起關鍵作用。 鈣調素結合蛋白(Caldesmon)分為高分子量Caldesmon(h-Caldesmon)和低分子量Caldesmon(1-Caldesmon)。兩者是

3、同一基因的不同拼接型，結構相似。1-Caldesmon可以和維狀肌動蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白、鈣調素相結合。1-Caldesmon在調節(jié)細胞骨架的動態(tài)平衡中起著重要作用，1-Caldesmon的功能變化在內皮細胞高通透性中扮演了重要角色。 一、研究目的 探討p38激酶和Caldesmon在燒傷早期血管通透性變化中的調控作用和機制。 二、材料方法 1．以體外培養(yǎng)的ECV304細胞和雙層培養(yǎng)系統(tǒng)制成單層血管

4、內皮細胞模型。 2．實驗分組：將細胞分為正常血清組(A組)、正常血清+SB203580組(B組)、燒傷血清組(C組)、燒傷血清+SB203580組(D組)、正常血清+重組腺病毒組(E組)、燒傷血清+重組腺病毒組(F組)組、空病毒組(G組)和重組腺病毒組(H組)。 3．構建Caldesmon重組腺病毒載體，包裝293細胞，制備重組腺病毒。 4．采用綠色熒光標記的白蛋白，觀察A組、B組、C組、D組、E組和F組單層內皮

5、細胞0.5h、1h、2h、4h時的通透性變化。 5．Western blot法檢測A組、B組、C組、D組p38、p-p38和p-Caldesmon表達變化以及G組和H組Caldesmon表達變化，利用免疫細胞化學染色觀察A組、B組、C組、D組細胞F-actin的形態(tài)。 三、主要結果 1．燒傷血清刺激后，單層內皮細胞的白蛋白濾過明顯增加，SB203580預處理明顯減少了單層內皮細胞白蛋白濾過。 2．正常內皮細胞p3

6、8激酶磷酸化水平較低，燒傷血清刺激后，p38激酶磷酸化水平明顯增高，SB203580預處理可以明顯抑制p38激酶磷酸化水平增高，而p38激酶蛋白表達水平無明顯變化。 3．正常內皮細胞F-actin排列成束狀，與細胞縱軸大致平行，細胞中央和周邊無顯著差異。燒傷血清刺激后，細胞F-actin明顯重排，細胞收縮變圓，SB203580預處理可以抑制F-actin的重排。 4．成功構建了Caldesmon重組腺病毒載體，重組腺病毒

7、滴度可達1×10<'9>U/ml，重組腺病毒感染內皮細胞后Caldesmon蛋白的表達明顯增高。 5．重組腺病毒感染內皮細胞明顯減少了燒傷血清刺激后單層內皮細胞白蛋白濾過。 6．正常內皮細胞磷酸化Caldesmon蛋白水平較低，燒傷血清刺激后，磷酸化Caldesmon蛋白水平明顯增高，SB203580預處理可以明顯抑制磷酸化Caldesmon蛋白水平增高。 四、討論與結論 1．燒傷血清可導致內皮細胞通透性

8、增高，p38激酶活性與燒傷血清導致的血管通透性增加密切相關。 2．細胞F-actin重排是燒傷血清刺激后單層血管內皮細胞通透性增高的重要機制，而內皮細胞F-actin重排受p38激酶調控。 3．成功構建了Caldesmon重組腺病毒載體，且染效率高，能夠有效表達目的基因，具有較高的感染力。Caldesmon蛋白在燒傷血清所引起的單層內皮細胞通透性增高中起重要作用。 4．燒傷血清可明顯增高內皮細胞磷酸化Caldes