犬α干擾素基因的克隆，表達及其活性測定.pdf

1、　　犬的α干擾素具有廣譜的抗病毒作用，有很高的研究應(yīng)用價值，因此本課題研究了犬的α干擾素，并對其基因進行了改造，在不同的表達系統(tǒng)中進行了表達和生物活性測定。具體的研究有以下幾個方面：　　1，以經(jīng)刀豆球蛋白A(ConA)誘導(dǎo)的犬外周血淋巴細胞中提取的總RNA為模板，通過RT-PCR的方法克隆擴增出犬α干擾素基因，再通過RT-PCR的方法克隆擴增出犬α干擾素成熟蛋白的全基因，將此基因克隆于原核表達載體pBV220，并將重組表達載體轉(zhuǎn)入幾種

2、不同的大腸桿菌中進行溫敏誘導(dǎo)表達，有的不能獲得明顯表達，只在改造過的大腸桿菌中獲得高效表達。通過分析發(fā)現(xiàn)是犬α干擾素基因中含有16﹪之多的大腸桿菌的稀有密碼子導(dǎo)致了基因的表達翻譯障礙。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，證明目的蛋白以包涵體的形式存在，大小約為19kDa。將表達產(chǎn)物變性、復(fù)性、透析、純化處理后加入犬腎細胞、牛腎細胞上用水泡性口炎病毒攻毒，測出重組的CaIFN-α具有較高的抗病毒作用，生物活性最高時達到5.11×106U/mg

3、?！　?，為了獲得具有天然結(jié)構(gòu)的重組犬α干擾素，本研究把犬α干擾素的成熟蛋白基因的5'端進行了改造后，把它克隆到具有分泌信號肽基因片段的酵母表達載體上，電轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母X-33中，將誘導(dǎo)表達的培養(yǎng)基上清收集進行簡單純化后，經(jīng)SDS-PAGE分析，表達的蛋白比原核表達系統(tǒng)的表達產(chǎn)物大幾kDa，分析其原因，是由于基因序列中有兩個潛在的糖基化位點，酵母的表達產(chǎn)物被加工糖基化了，或者還有其他的蛋白質(zhì)的加工修飾過程。也將酵母表達的重組犬α