林麝γ-干擾素基因的克隆及表達(dá).pdf

1、林麝是我國(guó)一級(jí)珍稀瀕危保護(hù)動(dòng)物。林麝分泌的麝香是高級(jí)香料，也是我國(guó)和東亞地區(qū)傳統(tǒng)的珍貴藥材，因此林麝具有很高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因?yàn)檫^(guò)度捕殺以及生境的喪失，林麝種群數(shù)量銳減。我國(guó)具有多年的麝馴化和人工養(yǎng)殖歷史，在1958年就開(kāi)始了人工圈養(yǎng)以及保護(hù)野生的林麝，并且也取得了一定的成效，但是目前人工養(yǎng)麝的技術(shù)不完善，圈養(yǎng)的林麝很容易受細(xì)菌、病毒感染，化膿性疾病一年四季都有發(fā)生，呈散發(fā)形式，表現(xiàn)慢性病程，發(fā)病多，病程長(zhǎng)，治愈率低，雖不及其他傳

2、染病那樣來(lái)勢(shì)兇猛，但死亡率高，約為麝群總死亡數(shù)的50％～70％，在疾病防治上一直沒(méi)有取得很大突破。 IFN-γ是免疫系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因子，主要由T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，能夠全面促進(jìn)體液免疫和細(xì)胞免疫。IFN-γ可增加T、B淋巴細(xì)胞的激活和IgG的Fc受體表達(dá)；顯著增強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)MHC類抗原，增強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞與T細(xì)胞的相互作用，進(jìn)而增強(qiáng)T細(xì)胞輔助抗體產(chǎn)生和輔助細(xì)胞毒T細(xì)胞產(chǎn)生的能力；誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，使機(jī)體免疫力顯著

3、增強(qiáng)。在人和其他物種中，IFN-γ已用于病毒性感染和腫瘤等多種疾病的臨床治療。因此，為了應(yīng)用IF-γ對(duì)林麝進(jìn)行免疫治療，提高林麝對(duì)外界環(huán)境的免疫水平，對(duì)此基因做了克隆、分析及原核、真核表達(dá)。 根據(jù)水牛IFN-γ基因的cDNA全序列為參考，設(shè)計(jì)兩條克隆引物，從經(jīng)ConA誘導(dǎo)的林麝外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)總RNA為模板，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出編碼林麝IFN-γ的基因并將其克隆到pMD18-T載體上。經(jīng)篩選、菌落PCR鑒定、測(cè)序

4、、序列分析，證實(shí)為林麝IFN-γ基因編碼序列，全長(zhǎng)498bp，編碼166個(gè)氨基酸，與偶蹄目動(dòng)物赤鹿、牛、羊的IFN-γ cDNA序列高度相似。將林麝IFN-γ重組到原核表達(dá)載體pGEX4T-1中，轉(zhuǎn)化E.coli BL21，在IPTG誘導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，SDS-PAGE分析得到約43KDa的蛋白質(zhì)條帶，與GST融合蛋白的預(yù)期分子量一致，表達(dá)量約占細(xì)菌總蛋白的26.9％。經(jīng)NaOH法變性復(fù)性后，用GSTrap親和柱對(duì)蛋白進(jìn)行了純化。

5、 將林麝IFN-γ基因與真核表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，通過(guò)菌落PCR、測(cè)序篩選構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒，經(jīng)線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，再經(jīng)G418抗性篩選、酵母菌落PCR鑒定，得到多個(gè)重組酵母，對(duì)這些酵母進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、SDS-PAGE、反轉(zhuǎn)錄分析，在兩株重組酵母經(jīng)甲醇誘導(dǎo)4d的上清中檢測(cè)到了約17.3KDa的誘導(dǎo)表達(dá)帶，但表達(dá)量極低，這表明林麝IFN-γ在畢赤酵母中的表達(dá)是低水平的，而在大腸桿菌中的表達(dá)