奶牛體細(xì)胞計(jì)數(shù)法與干擾素—Tau基因的克隆、表達(dá).pdf

1、乳房炎對奶牛養(yǎng)殖業(yè)危害十分大，乳房炎的發(fā)生可以通過體細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行監(jiān)測，特別對于亞臨床型乳房炎，越早監(jiān)測出越有利于預(yù)防臨床乳房炎的發(fā)生及改善牛群的整體健康狀況。目前對于體細(xì)胞計(jì)數(shù)有加利福尼亞細(xì)胞數(shù)測定(Califormia Mastitis Test，CMT)，威斯康辛乳腺炎試驗(yàn)(Wisconsin MastitisTest, WMT)，電子體細(xì)胞計(jì)數(shù)法，顯微鏡直接計(jì)數(shù)法等許多方法<'［10］>，其中CMT操作簡單但只能得出體細(xì)胞值

2、的一個(gè)相對范圍，不能得到精確的值；WMT雖能得到準(zhǔn)確的體細(xì)胞值但是實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜；DHI操作簡單準(zhǔn)確但需要專門的計(jì)數(shù)儀器、價(jià)格昂貴。本實(shí)驗(yàn)通過熒光染色的方法，運(yùn)用熒光顯微術(shù)對3個(gè)取樣點(diǎn)總計(jì)39頭奶牛乳汁中的體細(xì)胞分別進(jìn)行三次計(jì)數(shù)，取三次計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值作為每頭奶牛的體細(xì)胞值，并結(jié)合各奶牛場管理?xiàng)l件對結(jié)果進(jìn)行了分析，表明吖啶橙染色是一種快速、準(zhǔn)確的監(jiān)測奶牛體細(xì)胞數(shù)的方法，同時(shí)還表明不同的飼養(yǎng)條件及管理會(huì)造成牛群健康狀況的顯著差異，并依據(jù)實(shí)驗(yàn)

3、結(jié)果對改善牛群的健康狀況提出了建議。 本實(shí)驗(yàn)還根據(jù)己知的牛Bos taturus干擾素-τ(Interferon-Tau，IFN-τ)基因Genbank 登錄號(hào)分別為AF238611(IFN-τ-C3)、AF238612(IFN-τ-C2)、AF238613(IFN-τ-C1)和一個(gè)印度水牛Bubalus bubalis IFN-τ基因，Genbank登錄號(hào)AY535404的四個(gè)核苷酸序列設(shè)計(jì)出IFN-τ的克隆引物。從凍存的荷斯

4、坦奶牛血液中提取其基因組DNA，利用PCR擴(kuò)增出編碼荷斯坦奶牛IFN-τ基因片斷。并利用PET-39b表達(dá)載體對其進(jìn)行原核表達(dá)。結(jié)果表明，荷斯坦奶牛IFN-τ基因開放閱讀框全長588bp，編碼一個(gè)含195個(gè)氨基酸的多肽，其中前23個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，余下的172個(gè)氨基酸為成熟肽，推測成熟肽分子量約為17KD。在線利用NCBI進(jìn)行比對可知荷斯坦奶牛IFN-τ百基因的序列與水牛(Bubalus bubalis)、大額牛(BOS front

5、alis)、山羊(Capra hircus)、綿羊(Ovis aries)、長頸鹿(Giraffa camelopardalis)、馬鹿(Cervus elaphus)IFN-τ基因的核苷酸序列同源性分別為94.2[％]、91.2[％]、90.8[％]、90.6[％]、90.1[％]、88.4[％]。 同時(shí)利用該克隆引物首次克隆并測序了林麝、馬麝、牦牛、水鹿的IFN-τ基因，并依據(jù)測得的序列及Genbank上收錄的反芻動(dòng)物IFN

6、-τ序列，并加入牛和羊的：IFN-ω及人的滋養(yǎng)層分干擾素做比較，使用MEGA3.0軟件利用neighbor-joining(NJ)法分別基于核苷酸序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列的成熟肽序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行了分子進(jìn)化與系統(tǒng)發(fā)育方面的分析，結(jié)果支持IFN-τ從IFN-ω進(jìn)化來的觀點(diǎn)，同時(shí)討論了麝在反芻動(dòng)物中的進(jìn)化地位，結(jié)果支持麝作為獨(dú)立一科的觀點(diǎn)。 鑒于IFN-τ在反芻動(dòng)物妊娠識(shí)別、抗病毒包括反轉(zhuǎn)錄酶病毒、抗細(xì)胞增殖，各種疾病的跨種的