口蹄疫病毒受體豬源整聯(lián)蛋白基因的克隆及表達(dá).pdf

1、口蹄疫(Foot-and-MouthDisease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDiseaseVirus，F(xiàn)MDV)引起的牛、豬、羊和野生偶蹄動(dòng)物的一種急性高度接觸性傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類傳染病之首?？谔阋卟《臼切NA病毒科(Picornaviridae)、口瘡病毒屬(Aphthovirus)的代表性成員，有A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3以及Asial7個(gè)血清型。已有的研究證明，

2、FMDV至少有五種細(xì)胞識(shí)別機(jī)制，即細(xì)胞表面的整聯(lián)蛋白αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8和硫酸乙酰肝素可作為FMDV的受體。 本試驗(yàn)從OA/58株FMDV感染康復(fù)豬的舌皮和肺組織中提取總mRNA，根據(jù)GenBank中己發(fā)表的不同動(dòng)物的整聯(lián)蛋白αv、β1、β6亞基基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增(αv、β1、β6亞基基因，通過將產(chǎn)物與pGEM-TEasy載體連接，構(gòu)建重組克隆載體pGEM-αv、pGEM-β1、pGE

3、M-β6并進(jìn)行序列測(cè)定?；驕y(cè)序結(jié)果表明：本試驗(yàn)所獲得的新基因核苷酸序列和所編碼氨基酸的序列與GenBank中收錄的相對(duì)應(yīng)牛整聯(lián)蛋白基因一致性較高，都達(dá)到90％以上。 根據(jù)基因測(cè)序結(jié)果，分別重新設(shè)計(jì)并合成原核表達(dá)引物，以重組質(zhì)粒pGEM-αv、pGEM-β1、pGEM-β6為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增各亞基配體結(jié)合域(LBD)基因片段。然后將αvLBD擴(kuò)增產(chǎn)物與pPRoExHTb質(zhì)粒連接，β1LBD、β6LBD的擴(kuò)增產(chǎn)物分別與pGEX

4、-4T-1質(zhì)粒連接，構(gòu)建了重組原核表達(dá)載體pPRo-αvLBD、pGEX-β1LBD、pGEX-β6LBD，將其分別轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)宿主菌中，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，所表達(dá)的目的蛋白大部分以包涵體形式存在。將各包涵體純化，并分別免疫新西蘭大耳白兔制備多克隆抗體。SDS-PAGE分析表明，上述各基因片段在大腸桿菌中成功獲得了表達(dá)，αvLBD分子量大小為40000左右，GST-β1LBD、GST-β6LBD分子量均為42000左右，

5、與預(yù)期的大小相吻合。ELISA和WesternBlot分析表明兔抗αvLBD、β1LBD、β6LBD的效價(jià)都達(dá)到了1:12800以上，具有較高的特異性。 根據(jù)pGEM-β6開放閱讀框(ORF)兩側(cè)序列，設(shè)計(jì)并合成真核表達(dá)引物，以pGEM-β6為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增β6基因片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物與pCDNA3.1/(+)載體連接，構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pCDNA3.1/(+)β6，并轉(zhuǎn)染表達(dá)人αv亞基的結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480，檢測(cè)αvβ