口蹄疫病毒受體牛源整合素β6基因的研究.pdf

1、口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的牛、羊、豬等偶蹄類動物發(fā)生的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，對畜牧業(yè)的危害極大。整合素是介導(dǎo)FMDV感染的重要受體之一，是否起決定性作用及其機(jī)制尚不清楚。本文制備了抗牛整合素β6亞基的多抗、建立了穩(wěn)定表達(dá)β6亞基的細(xì)胞系、并檢測了整合素β6亞基在不同組織中的表達(dá)譜，為深入探討β6亞基在FMDV感染中的作用研究奠定了基礎(chǔ)。其具體研究結(jié)果如下:
　　1.牛整合素β6亞基基因的原核表達(dá)、

2、純化及多抗的制備
　　從牛甲狀腺組織中提取總RNA，根據(jù)GenBank中已發(fā)表的牛的β6亞基基因序列，設(shè)計(jì)并合成引物P1和P2，利用RT-PCR擴(kuò)增得到β6基因全長，將其亞克隆到pEASY-T3載體上，并進(jìn)行測序。序列分析表明:與已發(fā)表β6基因序列有99％的同源性。以β6重組pEASY-T3質(zhì)粒為模板，以P3和P4為引物，擴(kuò)增β6胞外域，將其重組到原核表達(dá)載體pET32a中，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)宿主菌，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒經(jīng)酶

3、切、PCR鑒定以及序列分析后，確認(rèn)獲得了β6胞外域重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-β6。用IPTG誘導(dǎo)β6胞外域融合蛋白的表達(dá)，所表達(dá)的目的蛋白大部分以包涵體形式存在，其分子量大小為94Kd左右，與預(yù)期的大小相吻合。應(yīng)用Ni-NTAbeads純化目的蛋白后，免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體。利用該抗體作為一抗，通過Western Blot檢測穩(wěn)定表達(dá)β6亞基的PK15細(xì)胞系，檢測到了β6蛋白，具有較高的特異性。該研究所獲得的多抗及其Wes

4、tern Blot方法為深入研究β6亞基的功能提供了技術(shù)手段。
　　2.牛整合素β6亞基基因的真核表達(dá)及穩(wěn)定細(xì)胞系的建立
　　設(shè)計(jì)并合成了β6亞基真核表達(dá)引物P5和P6，以pEASY-T3-β6重組質(zhì)粒為模板，以P5和P6為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到β6基因全長，通過BglП和NotI酶切后回收目的片段，連接到FG9載體上，構(gòu)建了真核表達(dá)載體FG9-β6，經(jīng)序列分析比對正確后，將其轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，利用Wester

5、n blot檢測β6蛋白表達(dá)情況。瞬時(shí)表達(dá)成功后，將重組質(zhì)粒FG9-β6轉(zhuǎn)染口蹄疫非敏感細(xì)胞株豬腎PK15細(xì)胞系，經(jīng)流式細(xì)胞分選GFP陽性細(xì)胞系。Western Blot驗(yàn)證GFP陽性豬腎細(xì)胞系可穩(wěn)定表達(dá)β6基因。該細(xì)胞系的建立為后續(xù)利用FMDV感染實(shí)驗(yàn)評估β6亞基是否是FMDV感染所必須的受體亞基的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　3.牛整合素β6亞基mRNA在不同組織中的表達(dá)水平
　　本實(shí)驗(yàn)建立了檢測牛整合素β6亞基mRNA表達(dá)的實(shí)