牛口蹄疫合成肽疫苗的研制及口蹄疫病毒蛋白與宿主細(xì)胞蛋白相互作用的研究.pdf

1、口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是一種具有高度傳染性和極具經(jīng)濟(jì)破壞性的病毒性疾病，主要感染牛、羊等反芻動(dòng)物、豬以及某些野生類偶蹄動(dòng)物。口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)是引發(fā)該病的病原體，隸屬小RNA病毒科口蹄疫病毒屬。雖然針對(duì)FMD采取了嚴(yán)格的檢疫制度以及疫苗接種等防控措施，但在我國(guó)及世界其它地區(qū)仍時(shí)有發(fā)生。研制更加安全有效的FMD新型疫苗具有重要性和緊迫性。

2、VP1是FMDV最重要的結(jié)構(gòu)蛋白和免疫原性蛋白，常被廣泛應(yīng)用于各種新型基因工程疫苗的研究。VP1蛋白通過(guò)與病毒自身編碼蛋白或宿主細(xì)胞蛋白相互作用而在病毒感染和抗宿主免疫等方面發(fā)揮多種功能。2B蛋白是FMDV的一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，具有多種活性，在FMDV感染和釋放以及誘導(dǎo)自噬等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。只有徹底了解FMDV蛋白與宿主細(xì)胞蛋白之間的相互作用關(guān)系及其發(fā)揮作用的各種機(jī)制，才能研制出更加安全有效的疫苗來(lái)預(yù)防該病。本研究初步研制了牛FMD合成

3、肽疫苗，探索了作為新型疫苗主要候選元件的VP1蛋白與宿主的相互作用，并研究了非結(jié)構(gòu)蛋白2B的宿主互作蛋白及其功能，為深入了解FMDV致病的分子機(jī)理以及研制新型疫苗提供了新思路和理論依據(jù)。本研究所獲得的主要結(jié)果如下:
　　1.以FMDV A/HuBWH/CHA/2009流行毒株結(jié)構(gòu)蛋白VP1上129～169位氨基酸、非結(jié)構(gòu)蛋白3A上21～35位氨基酸、3D上346～370位氨基酸為基礎(chǔ)表位片段，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了三組A型FMD合成肽疫苗，

4、分別在豚鼠和牛體內(nèi)進(jìn)行了免疫效力評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示以PB組，即3D(346～370)-PPS-VP1(129～134(T→C)～156(Q→C)～169)，免疫動(dòng)物產(chǎn)生的中和抗體滴度最高，攻毒保護(hù)效力最強(qiáng)。用其以50μg/只的劑量免疫豚鼠2次，可100％的抵抗同型病毒的攻擊;以100μg/頭份的劑量免疫牛1次，可達(dá)到60％的保護(hù)率。因此PB合成肽，有希望發(fā)展成為生產(chǎn)實(shí)踐中有效的牛FMD合成肽疫苗。本研究為進(jìn)一步發(fā)展和完善FMD合成肽疫苗奠定

5、了一定的基礎(chǔ)。
　　2.采集經(jīng)FMDV感染七天后的長(zhǎng)白豬敏感組織，構(gòu)建了高質(zhì)量的cDNA表達(dá)文庫(kù)。利用分裂-泛素酵母雙雜交系統(tǒng)，以FMDV VP1為誘餌蛋白篩選豬組織cDNA文庫(kù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞蛋白zyxin的C末端第329～572位氨基酸能夠與FMDV VP1蛋白發(fā)生相互作用。利用免疫共沉淀技術(shù)以及激光共聚焦技術(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證了FMDVVP1蛋白與宿主細(xì)胞蛋白zyxin確實(shí)存在相互作用且在細(xì)胞中存在共定位。在研究zyxin蛋白對(duì)

6、FMDV增殖的作用中發(fā)現(xiàn)，BHK-21細(xì)胞中zyxin蛋白的表達(dá)量隨FMDV感染時(shí)間上調(diào)。之后，利用靶向zyxin基因的特異性干擾小RNA分子沉默細(xì)胞內(nèi)源性zyxin蛋白的表達(dá)，經(jīng)TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)和細(xì)胞毒價(jià)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)下調(diào)zyxin蛋白的表達(dá)可抑制FMDV在細(xì)胞中的增殖，相反，過(guò)表達(dá)zyxin蛋白時(shí)可促進(jìn)FMDV的增殖。
　　3.以FMDV2B為誘餌蛋白篩選豬組織cDNA文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞蛋白eEF1G的第208～43