負載口蹄疫病毒VP4蛋白質(zhì)抗原的樹突狀細胞啟動的T細胞應(yīng)答.pdf

1、口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMD virus,FMDV)感染偶蹄動物引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。FMDV的抗原易發(fā)生變異,因此到目前還沒有有效的預(yù)防措施。FMDV的4種結(jié)構(gòu)蛋白中VP4幾乎不發(fā)生變異。并已證明,FMDV結(jié)構(gòu)蛋白1A(VP4)富含T細胞抗原表位與B細胞抗原表位的抗原分子。樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強大的專職抗原提呈細

2、胞(antigen presenting cell,APC)。
　　 實驗證明,FMDV野毒株并不感染DC,但在培養(yǎng)基上馴化的FMDV卻可以感染DC,并且與抗體結(jié)合后的FMDV也可以感染DC,導(dǎo)致其抗原提呈功能喪失,而當DC負載滅活FMDV免疫復(fù)合物后卻能夠有效地刺激T細胞。而細胞免疫應(yīng)答在抗病毒感染過程中發(fā)揮重要作用。被DC活化的T細胞在IL-12的作用下,可分化為Th1細胞,介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答并產(chǎn)生調(diào)理性抗體(IgG),從而清

3、除胞內(nèi)病原體感染。而在IL-4的作用下,有利于Th細胞向Th2細胞分化,介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答,產(chǎn)生中和抗體,清除外周循環(huán)中的病原體。目前尚不清楚DC啟動細胞免疫應(yīng)答的機制。
　　 本研究根據(jù)農(nóng)業(yè)部2008年12月12日發(fā)布的《動物病原微生物實驗活動生物安全要求細則》,既不使用活病毒,也不使用滅活病毒,首先按照GenBank上已公布的O型口蹄疫病毒的核苷酸序列合成pBlueseriptⅡ SK(+)-VP4,然后將pBluescrip

4、tⅡ SK(+)-VP4通過BamHI和XhoI位點插入到pET-32a(+)原核表達載體,構(gòu)建VP4的原核表達載體pET-32a-VP4。將VP4表達載體轉(zhuǎn)化宿主菌BL21,制備工程菌進行原核表達。通過對誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化,根據(jù)SDS-PAGE確定表達蛋白的最佳表達條件,利用載體的His-Tag標簽做Western blot鑒定。通過電洗脫純化VP4蛋白質(zhì)抗原。將荷載了FMDVVP4蛋白質(zhì)抗原的DCs與淋巴結(jié)T細胞共培養(yǎng),并以DCs+

5、T細胞和DCs作為對照組,在共培養(yǎng)3h,9h,24h和48h后,取其共培養(yǎng)上清液,ELISA檢測其中IFN-γ和IL-4的水平,從而研究FMDV VP4蛋白質(zhì)抗原對T細胞的活化效應(yīng)。
　　 本研究構(gòu)建的原核表達載體pET-32a-VP4經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切,得到了符合預(yù)期大小的特異性片段,測序結(jié)果與GenBank中Foot-and-mouth disease virus O isolateO／NYOO基因編碼VP4序列完

6、全一致,同源性為100％,證明原核表達載體pET-32a-VP4構(gòu)建成功。SDS-PAGE檢測宿主菌BL21表達目的蛋白的結(jié)果顯示:在IPTG濃度為1mmol／L,誘導(dǎo)后5h時表達量最大。經(jīng)Western blot鑒定其在25kDa處有雜交條帶,與預(yù)期目的蛋白大小相符。細胞共培養(yǎng)ELISA檢測結(jié)果顯示,負載FMDV VP4的DC能夠有效地激活淋巴結(jié)T細胞。這些結(jié)果不僅為進一步研究DCs對FMDV VP4抗原的提呈途徑打下了基礎(chǔ),而且為新