小鼠樹突狀細胞提呈口蹄疫病毒蛋白質(zhì)抗原的機制研究.pdf

1、目的：口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的牛、羊、豬等偶蹄動物的—種急性、高度接觸性、發(fā)熱性傳染病。FMDV也可感染人類，并表現(xiàn)出與動物類似的臨床癥狀。因此，被世界衛(wèi)生組織(WHO)把口蹄疫定為人獸共患傳染病。雖然該病已經(jīng)存在了四百多年，但尚不清楚機體對FMDV的免疫應答機制。樹突狀細胞(DC)不僅是動物機體的哨位細胞(sentinel.cell)，而且還是機體適應性免疫應答的啟動者，特別是DC還能夠交叉提呈非復制性抗原(例

2、如滅活的病毒等)，故被稱為機體最強大的抗原提呈細胞，但目前尚不清楚DC是否參與加工、提呈FMDV抗原。由于國家嚴格規(guī)定從事口蹄疫活病毒研究必須在生物安全三級實驗室以上的環(huán)境條件下進行，因此，本研究以滅活FMDV疫苗為抗原材料，通過觀察口服滅活FMDV疫苗后咽部引流淋巴結(jié)內(nèi)樹突狀細胞的分布變化，明確DC是否作為FMDV的抗原提呈細胞參與免疫應答，并進一步研究DC提呈FMDV抗原的機制。近年來，F(xiàn)MDV感染模型已經(jīng)在BALB/c小鼠成功復制

3、，因此，如果試驗結(jié)果證實了DC是滅活FMDV的抗原提呈細胞，將以BALB/c小鼠為試驗對象，通過體內(nèi)外試驗，進一步探討小鼠樹突狀細胞向CD4+T細胞和CD8+T細胞提呈滅活FMDV抗原的機制。 適應性免疫包括細胞免疫和體液免疫兩部分。眾所周知，如果沒有細胞免疫應答的適當啟動，特別是由CD4+T細胞介導的免疫應答，體液免疫應答就不可能得到建立，而且由CD8+T細胞介導的細胞免疫也是機體抵御病毒感染最有效的機制之一，所以，本研究選用

4、CD4+T細胞和CD8+T細胞作為接受DC提呈抗原的靶細胞。同時，CD4+T細胞和CD8+T細胞的活化也可作為反映MHC-II類分子和MHC-I類分子途徑提呈抗原的指標。 方法：FMDV主要經(jīng)消化道、呼吸道和受損傷的皮膚等途徑感染動物，并可在咽部大量繁殖，無論是自然感染動物，還是疫苗接種動物。因此，咽部可能在機體抗FMDV感染免疫中發(fā)揮特殊重要作用。根據(jù)黏膜免疫學理論，咽部引流淋巴結(jié)就是咽部黏膜免疫應答的誘導區(qū)，而咽部黏膜就是效

5、應區(qū)。 1.DC與FMDV關系的確定：為探明咽部DC是否參與滅活FMDV抗原的加工與提呈，研究者模擬自然感染途徑給BALB/c小鼠口服接種滅活FMDV疫苗，然后，在接種疫苗后不同時間點摘取咽部引流淋巴結(jié)(用墨汁追蹤法證實小鼠咽部引流淋巴結(jié)為頸淺淋巴結(jié))，按常規(guī)進行固定、脫水、透明和包埋，制備6-8μm厚石蠟組織切片，用兔抗牛S-100多克隆抗體對淋巴結(jié)進行免疫組織化學染色，觀察頸淺淋巴結(jié)內(nèi)DC的分布，根據(jù)DC在頸淺淋巴結(jié)內(nèi)的數(shù)量

6、變化與分布變化判斷其是否參與FMDV抗原的提呈。 2.口服滅活FMDV疫苗誘導的細胞免疫應答：將36只8周齡BALB/c小鼠隨機分為6組，每組6只。1組、2組、3組、4組、5組小鼠口服滅活Asia I-O型雙價滅活疫苗(100/μl/只)，并分別于接種疫苗后24h、48h、72h、96h、120h在無菌條件下收集外周血，制備血清。第6組小鼠口服滅菌PBS(pH7.2)緩沖液(100/μl/只)作為對照。以血清IFN-γ水平為指標

7、(反映機體的Th1應答和CD8+T細胞應答)，用ELISA法檢測小鼠對滅活FMDV疫苗的細胞免疫應答。 3.BALB/c小鼠單核細胞源樹突狀細胞(MoDC)的制備：按常規(guī)方法進行，并用免疫細胞化學法和流式細胞術對其進行鑒定。 4.MoDC對滅活FMDV抗原的泛素化作用：將滅活FMDV疫苗負載于MoDC，并在RPMI 1640培養(yǎng)基中進行細胞培養(yǎng)，然后在不同時間點將MoDC裂解，以裂解液為材料進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后用

8、western blotting 法檢測MoDC內(nèi)的泛素化蛋白以及泛素化作用出現(xiàn)的時間。 5.負載滅活FMDV的MoDC對淋巴結(jié)T細胞免疫應答的啟動作用：將負載了滅活FMDV的MoDC與淋巴結(jié)CD4+T細胞和CD8+T細胞在RPMI1640培養(yǎng)基中進行共培養(yǎng)。用抗CD4抗體或抗CD8抗體分別阻斷CD4+T細胞或CD8+T細胞的活化，分別在第9h、12h、24h、36h、48h收集上清液，用ELISA檢測IFN-γ含量。

9、6.MoDC提呈滅活FMDV抗原的機制：分別用溶酶體抑制劑和蛋白酶體抑制劑處理MoDC，2h后將滅活FMDV負載于MoDC，隨即與CD4+T細胞或CD8+T細胞共培養(yǎng)，分別在第9h、12h、24h、48h收集上清液，用ELISA檢測其IFN-γ的含量。 結(jié)果：1.DC與FMDV關系的確定：小鼠頸淺淋巴結(jié)內(nèi)DC的數(shù)量在口服FMDV滅活疫苗24h后開始增多，散在分布于皮質(zhì)區(qū)內(nèi)。48h后小鼠頸淺淋巴結(jié)內(nèi)DC的數(shù)量明顯增多，并且主要分布

10、于副皮質(zhì)區(qū)。在72h后，咽部DC向頸淺淋巴結(jié)副皮質(zhì)區(qū)的遷移達到頂峰，依然聚集在副皮質(zhì)區(qū)。至96h，頸淺淋巴結(jié)內(nèi)DC的數(shù)量急劇下降，在皮質(zhì)區(qū)和副皮質(zhì)區(qū)內(nèi)只有少量DC呈現(xiàn)散在分布狀，此即樹突狀細胞疲勞。然而，120h后，頸淺淋巴結(jié)內(nèi)DC的數(shù)量再次增多，且主要分布于皮質(zhì)區(qū)。而PBS對照組未見類似改變。這說明DC就是FMDV的抗原提呈細胞。 2.口服滅活FMDV疫苗誘導的細胞免疫應答：接種疫苗24h后，小鼠血清內(nèi)的IFN-γ量開始升高(

11、10.1568±0.4689)，但與PBS對照組相(10.0512±0.0684)比差異不顯著(P>0.05)，而48h后，接種疫苗組小鼠血清內(nèi)的IFN-γ量明顯升高(10.7161±0.2199)，與PBS對照組(10.0748±0.0571)相比，差異極顯著(P<0.01)。在接種72h后，接種疫苗組小鼠血清內(nèi)的IFN-γ量達到最高峰(11.6784±0.4590)，與PBS對照組(10.1249±0.1498)相比，差異極顯著(P

12、<0.01)。96h后，IFN-γ含量開始下降(10.9839±0.3633)，與PBS對照組(10.0933±0.0954)相比，差異顯著(P<0.05)，到120h時，試驗組(10.5285±1.3903)與PBS對照組相(10.0534±0.1543)比差異不顯著(P>0.05)。這表明口服滅活FMDV疫苗所誘導的細胞免疫應答與DC向引流淋巴結(jié)內(nèi)的遷移模式相一致。 3.BALB/c小鼠MoDC的制備：免疫細胞化學試驗和流式

13、細胞術檢測均顯示，本試驗所制備的MoDC純度大于99％。 4.MoDC對滅活FMDV抗原的泛素化作用：所有負載滅活FMDVMoDC中均發(fā)生了FMDV抗原的泛素化現(xiàn)象，而未負載滅活FMDV的MoDC中泛素化蛋白質(zhì)檢測則呈現(xiàn)陰性反應。在負載滅活FMDV疫苗0.5h后，MoDC內(nèi)就出現(xiàn)了泛素化FMDV蛋白，分子量大約為75kD；3h后，泛素化蛋白含量稍有增加，但從不同時間點來看，泛素化蛋白含量變化趨勢不明顯。 5.MoDC提呈

14、滅活FMDV抗原的機制：在滅活FMDV負載MoDC與CD4+T細胞共培養(yǎng)9h即有大量IFN-γ產(chǎn)生，而與FMDV負載MoDC共培養(yǎng)的CD8+T細胞在受到抗原刺激后24h才大量釋放IFN-γ。用溶酶體抑制劑或蛋白酶體抑制劑分別處理MoDC，2h后再分別與CD4+T細胞或CD8+T細胞共培養(yǎng)，按前述方法檢測上清液中IFN-γ的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種抑制劑均在共培養(yǎng)后9h顯著抑制CD4+T細胞產(chǎn)生IFN-γ。值得注意的是，溶酶體抑制劑顯著抑制滅

15、活FMDV負載DC刺激CD8+T細胞產(chǎn)生IFN-γ的能力，而蛋白酶體抑制劑卻促進CD8+T細胞產(chǎn)生IFN-γ，但是，同時用兩種抑制劑處理DC，CD8+T細胞產(chǎn)生IFN-γ的能力又顯著下降。這些復雜現(xiàn)象提示MoDC主要以交叉提呈抗原的方式激活淋巴結(jié)T細胞，并以產(chǎn)生IFN-γ為特征。但是，CD8+T細胞產(chǎn)生IFN-γ的時間明顯晚于CD4+T細胞，并且IFN-γ釋放也呈現(xiàn)多樣性。 結(jié)論：1.咽部DC是滅活FMDV的抗原提呈細胞，但在D

16、C捕獲滅活FMDV抗原后的遷移過程中表現(xiàn)出“疲勞”特征(Dendritic cell exhaustion)。 2.小鼠口服接種滅活FMDV疫苗可以誘導細胞免疫應答，并以產(chǎn)生IFN-γ為特征。 3.滅活FMDV抗原被DC捕獲后發(fā)生了兩種不同的泛素化現(xiàn)象，即多鏈泛素化和單鏈泛素化。但泛素化FMDV蛋白質(zhì)抗原主要被FK2抗體標記，而FK1抗體標記的較少。由于FK1只特異性地結(jié)合多鏈泛素化蛋白質(zhì)，F(xiàn)K2則同時結(jié)合單鏈泛素化蛋白

17、質(zhì)和多鏈泛素化蛋白質(zhì)，并且二者都不與游離的泛素結(jié)合。所以，滅活FMDV蛋白質(zhì)抗原主要在DC內(nèi)被多鏈泛素化。 4.泛素化的FMDV蛋白質(zhì)抗原既可被蛋白酶體降解，也可在溶酶體內(nèi)被加工處理，所產(chǎn)生的抗原肽主要以交叉提呈的方式提呈給CD4+T細胞或CD8+T細胞。CD4+T細胞只能識別裝載著抗原表位的MHC-II類分子，所以，溶酶體抑制劑造成的IFN-γ含量顯著下降清楚地表明，DC能夠以溶酶體-MHC-II類分子途徑按常規(guī)提呈FMDV抗

18、原。而蛋白酶體抑制劑對CD4+T細胞分泌IFN-γ的強大抑制作用則提示，DC內(nèi)還可能存在以蛋白酶體-MHC-II類分子途徑交叉提呈FMDV抗原的機制。并且CD4+T細胞被抗原肽激活后主要分化為Th1細胞亞類，分泌高水平的IFN-γ。從上述結(jié)果不難看出，F(xiàn)MDV負載的DC則主要以“內(nèi)吞小體-溶酶體-MHC-I類分子途徑”交叉提呈抗原肽給CD8+T細胞，從而啟動CTL應答。與DC遷移疲勞現(xiàn)象一致，CD8+T細胞產(chǎn)生IFN-γ的能力在被活化后