整合素CD11b抑制樹突狀細胞抗原交叉提呈的機制研究.pdf

1、免疫活化和免疫耐受極大地依賴于抗原提呈的程度與免疫細胞的功能狀態(tài)，作為專職的抗原提呈細胞和適應性免疫應答反應的始動者，樹突狀細胞(dendritic cell，DC)可以攝取、加工處理外源性抗原并以MHC-II類分子抗原肽復合物的形式提呈給CD4+T細胞。除此之外，DCs也可以將抗原以MHC-I類分子提呈給CD8+T細胞，即細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte, CTL)，這種特殊的抗原提呈方式被稱為抗原交叉提呈

2、反應 (cross-priming)。已知DCs在病毒入侵、細菌感染以及腫瘤浸潤的免疫防御反應中均發(fā)揮著重要的作用，而在此過程中，DCs分泌的IL-12p70不僅能促進CTL免疫突觸的形成，還可以延長CTL-DC的相互作用從而促進CTL的增殖和IFN-γ的產(chǎn)生。DC初始化CTL的抗原交叉提呈反應可以在多個層面被調(diào)控，比如活化的共刺激信號和減弱的促凋亡信號均能增強抗原交叉提呈反應，但是仍有很多調(diào)控抗原交叉提呈反應的正向和負向調(diào)節(jié)子亟待發(fā)現(xiàn)

3、和進一步深入研究。
　　 Β2整合素(CD11/CD18)在免疫反應和炎癥過程中均發(fā)揮了重要的作用。根據(jù)其不同的α亞基，可以將其分為4種功能不同的異二聚體，分別為：白細胞功能相關性抗原(leukocyte function-associated antigen 1, LFA-1; CD11a/CD18, αLβ2 integrin, ITAlantigen), Mac-1(CD11b/CD18, αMβ2 integrin, I

4、TAM antigen), p150,95 (CD11c/CD18, αXβ2 integrin, CR4, ITAX antigen)和αDβ2 (CD11d/CD18, ITAD antigen)。其中CD11b廣泛表達于多種免疫細胞亞群，如DCs、單核細胞、巨噬細胞、粒細胞和自然殺傷細胞等，并參與了細胞活化、細胞趨化、細胞毒和吞噬等多種生物學過程。本實驗室的前期研究表明CD11b可以分別通過負向調(diào)控NK細胞的TLR3信號通路和巨噬

5、細胞的TLR4信號通路來維持免疫耐受并抑制炎性反應。CD11b同樣高表達于DC表面，已有研究表明DC表面的CD11b可以抑制DC初始的CD4+T細胞活化并通過破壞Th17的分化促進外周耐受的形成。這些結(jié)果表明CD11b在調(diào)控T細胞適應性免疫應答中的作用至關重要。在CTL活化過程中，普遍為大家多接受的是，TLR4配體LPS和TLR9配體CpG-ODN可以增強DC初始的CTL抗原交叉提呈反應，然而有關CD11b在抗原交叉提呈反應中的作用為何

6、目前尚不知曉。
　　 作為DC表面重要的兩個TLR受體，TLR4和TLR9均可以促進DC成熟及其炎性因子分泌，但它們卻依賴于不同的信號轉(zhuǎn)導途徑。在DC中，LPS主要以MyD88（myeloid differentiation factor 88）依賴的方式促進炎性因子的產(chǎn)生，而通過TRIF（TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β）接頭分子誘導共刺激分子的上調(diào)，如CD40、CD80

7、和CD86等。TLR9啟動信號級聯(lián)反應則是特異性的通過接頭分子MyD88來活
　　 化NF-κB和MAPK信號通路導致DC的成熟和炎性因子的分泌。
　　 miRNAs（MicroRNAs）是一種非編碼的具有調(diào)節(jié)功能的RNA，它們可以通過抑制轉(zhuǎn)錄和誘導mRNA降解在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達，在免疫反應中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)功能。在天然免疫、炎癥反應和病毒感染等進程中，miR-146a發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。TLR信號通路的活化和

8、炎性刺激均可以導致miR-146a的上調(diào)，繼而依賴一些已知的靶調(diào)節(jié)免疫反應，如IL1-R-associated kinase (IRAK) 1, IRAK2, TNFR-associated factor (TRAF) 6和Tata Binding Protein (TBP)等。已有研究表明，miR-146a的上調(diào)主要是依賴于NF-κB活化，但其具體精細的調(diào)控機制知之甚少，此外，一個單獨的miRNA可以靶向多個mRNA發(fā)揮生物學功能，所

9、以仍然有很多miR-146a的潛在的靶亟待發(fā)現(xiàn)并鑒定其功能。
　　 在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與正常對照小鼠DC相比，CD11b缺陷小鼠DC在TLR9激動劑刺激下IL-12p70明顯上調(diào)，同樣該DC初始的CTL抗原交叉提呈反應也顯著增加，表現(xiàn)為CTL進一步增殖和IFN-γ分泌增加，這就表明CD11b在該過程中發(fā)揮著一種負向調(diào)節(jié)功能。進一步探討其機制發(fā)現(xiàn)CD11b參與了TLR9介導的miR-146a上調(diào)，DC中上調(diào)的miR-146a進一

10、步靶向Notch1從而抑制了IL-12p70的產(chǎn)生，因此，我們的實驗結(jié)果揭示了CD11b具有抗原交叉提呈反應調(diào)控作用的新功能并對于其作用機制有了初步的認識。
　　 1.CD11b通過抑制TLR9激動劑觸發(fā)的IL-12p70而減弱抗原交叉提呈反應
　　 為了探究CD11b對抗原交叉提呈反應的影響，我們首先制備了正常小鼠和CD11b缺陷小鼠的骨髓來源的樹突狀細胞（Bone marrow-derived dendritic c

11、ells, BMDC），分別用TLR4激動劑LPS和TLR9激動劑CpG-ODN刺激一天誘導其成熟而作為抗原提呈細胞，然后分選OT-I小鼠脾臟CD8+T細胞作為反應細胞，負載OVA抗原后與maDCs （mature DCs）共培養(yǎng)，以此來模擬抗原交叉提呈反應。我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，CD11b缺陷小鼠在CpG-ODN刺激后可以通過促進CTL的增殖以及IFN-γ的分泌來增強抗原交叉提呈反應，而LPS刺激情況下則無明顯改變，表明CD11b抑

12、制了TLR9激動劑而非TLR4激動劑誘導的抗原交叉提呈反應。
　　 為了進一步明確其具體機制，我們首先利用流式細胞儀對比了正常小鼠和CD11b缺陷小鼠DC的表型，結(jié)果無論是imDCs （immature DCs）還是LPS或CpG-ODN刺激后的DC，其上的MHC-I、MHC-II、CD40、CD70、CD80和CD86均沒有明顯改變，表明CD11b并非通過影響DC表型發(fā)揮作用，隨后借助ELISA，我們對比了兩種DC在TLR4和

13、TLR9激動劑刺激后IL-6、TNF-α和IL-1β的表達情況，結(jié)果依然沒有顯著差異，但是CD11b缺陷小鼠DC在TLR9激動劑刺激情況下IL-12p70卻顯著上調(diào)，且特異性IL-12p70中和性抗體能減弱正常小鼠DC和CD11b缺陷小鼠DC所誘導的抗原交叉提呈反應并縮小其組間差異，因為諸多研究表明IL-12p70可以增強CTL活化，所以，該部分結(jié)果表明CD11b通過抑制TLR9激動劑觸發(fā)的IL-12p70進而減弱抗原交叉提呈反應。

14、r>　　 2.CD11b促進CpG-ODN誘導的miR-146a上調(diào)依賴于NF-κB的晚期活化
　　 CD11b缺失后只改變了IL-12p70的分泌而對DC表型和炎性因子產(chǎn)生均無明顯影響，表明CD11b很有可能并非直接調(diào)控DC內(nèi)TLR9信號通路，而是借助一些其他途徑和機制特異性的調(diào)節(jié)了IL-12p70的產(chǎn)生。
　　 鑒于miRNA可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達，我們挑選了一些候選miRNA進行檢測來驗證是否CD11b通過

15、改變miRNA的表達調(diào)控了IL-12p70的分泌。據(jù)文獻報道，miR-21可以直接調(diào)控IL-12p35，然而在我們的體系中CD11b缺陷與否對其表達豐度并無影響，miR-146a和miR-155都可以在TLR配體刺激下上調(diào)，通過實時定量PCR我們發(fā)現(xiàn)，無論CD11b缺陷與否，LPS和CpG-ODN均能有效的誘導miR-155上調(diào)，而DC中CD11b缺失后特異性的抑制了CpG-ODN誘導的miR-146a上調(diào)，而對LPS刺激的miR-14

16、6a上調(diào)無影響，且pri-miR-146a的表達趨勢與miR-146a一致表明CD11b在轉(zhuǎn)錄水平參與調(diào)控了miR-146a的上調(diào)。此外NF-κB抑制劑PDTC可以有效的阻斷正常小鼠DC中CpG-ODN誘導的miR-146a上調(diào)，提示CD11b以NF-κB依賴的方式輔助了miR-146a上調(diào)。同時通過免疫蛋白印跡實驗我們動態(tài)觀測了CpG-ODN刺激后，正常小鼠DC和CD11b缺陷小鼠DC的NF-κB活化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD11b并未影響早

17、期的NF-κB的活化，從而解釋了炎性因子沒有改變的原因，而CD11b缺失后NF-κB的晚期活化明顯減弱，導致了miR-146a無法上調(diào)。
　　 3.miR-146a通過靶向Notch1抑制CpG-ODN誘導DC產(chǎn)生的IL-12p70
　　 miRNA主要通過靶向mRNA發(fā)揮生物調(diào)節(jié)功能，且已知的miR-146a的靶IRAK1、IRAK2、TRAF6和TBP貌似不會調(diào)控IL-12p70的分泌，所以很有可能存在miR-146

18、a的新靶調(diào)控了IL-12p70的表達，通過TargetScan（http://www.targetscan.org），我們對miR-146a的作用靶分子進行了預測，并發(fā)現(xiàn)Notch1在各種屬間擁有保守的miR-146a結(jié)合位點，且已有研究表明TLR的活化可以激活Notch1信號，且Notch1的活化與M1型巨噬細胞高分泌IL-12p70存在正相關，提示miR-146a很有可能靶向Notch1抑制IL-12p70的產(chǎn)生，通過報告基因?qū)嶒瀸?/p>

19、其進行進一步驗證發(fā)現(xiàn)，與mimic control相比miR-146a mimic能顯著抑制含miR-146a結(jié)合位點的Notch1的3’UTR區(qū)正常報告基因質(zhì)粒的活性，而對結(jié)合位點突變組無明顯差別，表明miR-146a確實可以靶向Notch1。
　　 接下來我們比較了對照組與CD11b缺陷組DC的Notch1全長片段（Notch FL）和Notch1胞內(nèi)段（Notch intracellular domain, NICD）的固

20、有表達情況以及在CpG-ODN刺激后的表達情況，結(jié)果顯示，靜息情況下，CD11b缺陷組DC的Notch FL和NICD1的表達即高于對照組，而CpG-ODN刺激后Notch FL和NICD1均明顯上調(diào)且在CD11b缺陷組上調(diào)更為明顯，表明CD11b很有可能通過抑制Notch1的表達來減少IL-12p70的分泌。此外，為了驗證miR-146a對Notch1的影響，在將miR-146a mimic、mimic control、miR-146

21、a inhibitor和inhibitor control轉(zhuǎn)染至CD11b缺陷DC和正常DC之后我們分別在RNA水平和蛋白水平檢測了Notch1的表達情況，結(jié)果與預期的情況一致，miR-146a mimic明顯抑制了Notch1的表達，而miR-146a inhibitor正好相反，表明在DC中Notch1確實是miR-146a的一個新靶，通過轉(zhuǎn)錄抑制和mRNA降解的機制被miR-146a所調(diào)控。
　　 隨后通過RNA干擾實驗我

22、們發(fā)現(xiàn)，無論是在正常小鼠DC還是CD11b缺陷小鼠DC，干擾Notch1后可明顯降低CpG-ODN誘導的IL-12p70的分泌，表明Notch1參與了CpG-ODN誘導的IL-12p70產(chǎn)生。最后為了驗證miR-146a是否對CpG-ODN誘導的IL-12p70同樣具有調(diào)控作用，我們在轉(zhuǎn)染miRNA之后檢測了IL-12p70的變化，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-146a mimic過表達miR-146a后，較正常組CD11b缺陷小鼠DC組CpG-

23、ODN刺激分泌的IL-12p70顯著下調(diào)，而較CD11b缺陷小鼠DC正常小鼠DC轉(zhuǎn)染miR-146a inhibitor后IL-12p70明顯上調(diào)，可見CD11b的確通過輔助miR-146a的上調(diào)繼而靶向Notch1來抑制了CpG-ODN觸發(fā)的IL-12p70產(chǎn)生。
　　 結(jié)語：綜上所述，CD11b參與、輔助了CpG-ODN誘導DC中miR-146a上調(diào)并由此靶向Notch1繼而抑制了IL-12p70的產(chǎn)生，最終減弱了DC的抗原