Notch信號(hào)途徑對(duì)小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞抗原提呈功能和Th1-Th2偏轉(zhuǎn)潛能的影響.pdf

1、樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendriticcell，DC)是專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞，其對(duì)免疫系統(tǒng)強(qiáng)有力的調(diào)節(jié)作用為腫瘤治療開(kāi)辟了新的途徑。DC疫苗是指負(fù)載腫瘤抗原的DC，其能在患者體內(nèi)誘發(fā)抗原特異性的T細(xì)胞反應(yīng)進(jìn)而殺死腫瘤細(xì)胞。在DC的分化和發(fā)揮功能過(guò)程中，Notch信號(hào)途徑是必須的。文獻(xiàn)報(bào)道Notch配體Jagged-1能對(duì)DC的分化起抑制作用。而我們利用過(guò)表達(dá)Notch配體DLL1（Delta-like1）的OP9基質(zhì)細(xì)胞與野生型小鼠骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)誘

2、導(dǎo)生成DC，觀察DLL1對(duì)DC分化和對(duì)其負(fù)載EL4淋巴瘤抗原后的提呈功能的影響，以期在DC誘導(dǎo)分化過(guò)程中，通過(guò)調(diào)節(jié)Notch信號(hào)產(chǎn)生更有效的DC腫瘤疫苗。
　　DC通過(guò)模式識(shí)別受體，如TLR來(lái)識(shí)別病原體，進(jìn)而與T細(xì)胞發(fā)生相互作用并影響T輔助細(xì)胞向Th1或Th2極化。具有誘發(fā)Th1反應(yīng)潛能的DC被命名為DC1；而能誘發(fā)Th2反應(yīng)的則被稱(chēng)為DC2。胞內(nèi)菌感染引發(fā)以分泌IFN-γ為特征的Th1反應(yīng)，而寄生蟲(chóng)感染觸發(fā)以分泌IL-4、IL-

3、5和IL-13為特征的Th2反應(yīng)。TLR信號(hào)能激活NF-κB途徑。多項(xiàng)研究報(bào)道Notch信號(hào)途徑對(duì)NF-κB起調(diào)控作用。我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在GM-SCF和IL-4存在情況下，RBP-J敲除小鼠骨髓細(xì)胞生成的DC數(shù)量較少且樹(shù)突少。并且，RBP-J-/-DC的表面分子MHCⅡ的表達(dá)量較低，抗原提呈功能較弱。本實(shí)驗(yàn)中，我們用LPS或PolyI:C刺激RBP-J+/-DC和RBP-J-/-DC，檢測(cè)其N(xiāo)otch配體表達(dá)水平、細(xì)胞因子分泌量和與

4、之相互作用的T細(xì)胞極化情況。文獻(xiàn)報(bào)道這些Notch配體的轉(zhuǎn)錄受NF-κB的調(diào)控。因此，我們可以推測(cè)DC表面Notch配體表達(dá)水平是TLR、NF-κB和Notch共同調(diào)控的結(jié)果。
　　我們已取得如下實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.在GM-CSF和IL-4存在的情況下，野生型小鼠骨髓細(xì)胞與OP9-DLL1或OP9-GFP共培養(yǎng)8天。與OP9-GFP組相比，和OP9-DLL1共培養(yǎng)生成的DC數(shù)量更多。
　　2.我們使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)成熟

5、DC表面分子的表達(dá)情況。和OP9-DLL1共培養(yǎng)生成的DC經(jīng)EL4腫瘤抗原刺激成熟后，其表面MHCⅡ、共刺激分CD80和CD86表達(dá)量更高。
　　3.使用ELISA試劑盒檢測(cè)DC經(jīng)EL4腫瘤抗原刺激成熟后細(xì)胞因子分泌水平。OP9-DLL1組DC分泌更多的IL-12，而IL-10的分泌量卻較少。
　　4.與OP9-DLL1共培養(yǎng)得到的DC負(fù)載腫瘤抗原后，與靜息狀態(tài)的T細(xì)胞共孵育。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，DLL1組的T細(xì)胞具有更強(qiáng)的

6、擴(kuò)增能力。
　　5.從PolyI:C誘導(dǎo)的RBP-J敲除的小鼠中得到骨髓細(xì)胞并按上述同樣方法誘導(dǎo)其分化成DC。我們使用Real-timePCR檢測(cè)經(jīng)LPS或PolyI:C刺激成熟的DC表面Notch配體的mRNA表達(dá)水平。LPS與TLR4結(jié)合能上調(diào)DC表面Jagged-1，Delta-like1和Delta-like4的表達(dá)水平。并且，RBP-J-/-DC上這三種Notch配體上調(diào)程度低于RBP-J+/-DC。而這兩種DC經(jīng)LPS

7、刺激后，其他配體Jagged-2和Delta-like3表達(dá)情況沒(méi)有明顯差別。PolyI:C刺激DC后產(chǎn)生相似結(jié)果。
　　6.經(jīng)LPS或PolyI:C作用后，與RBP-J+/-DC相比，RBP-J-/-DC分泌較多的IL-10和較少的IL-12。但是IL-6和TNF-α的分泌量卻沒(méi)有明顯區(qū)別。
　　7.我們使用流式胞內(nèi)染色法和ELISA試劑盒檢測(cè)靜息狀態(tài)T細(xì)胞與RBP-J+/-DC或RBP-J-/+DC相互作用后細(xì)胞因子的分

8、泌量。兩種檢測(cè)結(jié)果均顯示：與RBP-J+/-DC共孵育的T細(xì)胞分泌較多的IFN-γ；而RBP-J-/-DC能使T細(xì)胞產(chǎn)生較多的IL-4。
　　8.在DC與T細(xì)胞共孵育的第三天和第五天，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞的增殖能力。與RBP-J+/-DC組相比，RBP-J-/-DC組的T細(xì)胞擴(kuò)增能力較弱。
　　綜上所述，Notch配體DLL1能促進(jìn)小鼠骨髓細(xì)胞向DC分化并且增強(qiáng)其抗原提呈功能。刺激物與TLR結(jié)合使DC具有影響Th1或Th