Notch信號(hào)缺失對(duì)小鼠樹突狀細(xì)胞抗腫瘤免疫功能的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、樹突狀細(xì)胞（Dendriticcell,DC）是專職的抗原提呈細(xì)胞（Antigenpresentingcell,APC），可以誘發(fā)特異的抗病原體和腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)。不成熟的DC位于組織和周圍淋巴器官，監(jiān)視和識(shí)別外源性和內(nèi)源性抗原，并通過吞噬、微吞飲和胞吞作用獲取抗原。攝取抗原后，不成熟的DC會(huì)發(fā)生一些列的變化，包括上調(diào)細(xì)胞表面MHCII、共刺激分子及趨化因子受體的表達(dá)、增加細(xì)胞因子的分泌、細(xì)胞突起增多，并且向周圍淋巴器官遷移。在引流淋

2、巴器官中，負(fù)載抗原的DC可以通過MHCII-抗原肽-TCR復(fù)合物活化初始狀態(tài)的T細(xì)胞，并且通過特異的配體表達(dá)及細(xì)胞因子的分泌活化B細(xì)胞和NK細(xì)胞。
　　DC在抗腫瘤免疫中也發(fā)揮了極其重要的作用。DC被認(rèn)為是可以產(chǎn)生有效抗腫瘤免疫反應(yīng)的非常有前景的生物藥物，因?yàn)槠淇梢源罅揩@得且可以在體外通過許多不同途徑促進(jìn)其成熟，并被運(yùn)送到淋巴結(jié)以活化能夠特異殺傷腫瘤細(xì)胞的T細(xì)胞。雖然在一部分小鼠荷瘤模型中DC疫苗的應(yīng)用產(chǎn)生了極其有效的抗腫瘤免疫反

3、應(yīng)，但是，在對(duì)人前列腺癌和黑色素瘤的三期臨床試驗(yàn)中卻遭遇失敗。因此，關(guān)于調(diào)節(jié)DC成熟活化分子機(jī)制的進(jìn)一步研究和理解對(duì)DC的抗腫瘤免疫治療非常必要。
　　Notch信號(hào)是進(jìn)化過程中高度保守的信號(hào)通路之一，胚胎期和出生后期在神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)和脈管系統(tǒng)等多種系統(tǒng)中參與了細(xì)胞命運(yùn)決定、細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程。在哺乳動(dòng)物中，Notch信號(hào)共有四個(gè)受體(Notch1-4)和五個(gè)配體(Jagged1,Jagged2,andDelta-li

4、ke(Dll)1,3,and4)。當(dāng)配體與受體結(jié)合后，Notch受體胞內(nèi)段（NIC）隨即轉(zhuǎn)位入核，與轉(zhuǎn)錄因子RBP-J相互作用，去除其對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用，并且募集多種蛋白形成轉(zhuǎn)錄共激活物，以活化并調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
　　Notch信號(hào)在免疫系統(tǒng)的發(fā)育過程中同樣發(fā)揮了重要作用，包括調(diào)控T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC、髓系細(xì)胞的發(fā)育、免疫突觸(IS)形成和Th1/Th2偏轉(zhuǎn)等。在DC發(fā)育成熟過程中，不同Notch配體所產(chǎn)生的

5、效應(yīng)是不同的。研究報(bào)道，Dll1可以促進(jìn)DC分化，而Jagged1可能抑制DC分化且促進(jìn)不成熟髓樣細(xì)胞聚集，但其可以促進(jìn)人單核細(xì)胞來源DC的成熟。而小鼠體內(nèi)Notch1下調(diào)或缺失可以顯著的損傷DC分化。盡管大量文獻(xiàn)報(bào)道Notch信號(hào)會(huì)對(duì)DC發(fā)育產(chǎn)生影響，但其具體機(jī)制仍有待深入研究。
　　Wnt信號(hào)通路是一個(gè)很復(fù)雜的信號(hào)通路，在各物種之間高度保守。最初認(rèn)為Wnt信號(hào)通路由β-catenin介導(dǎo)，在過去15年中學(xué)者們又發(fā)現(xiàn)了至少三條β

6、-catenin非依賴的Wnt信號(hào)通路。在上述三條信號(hào)通路中，鈣離子被認(rèn)為是非常重要的第二信使。Wnt配體為分泌型糖蛋白，如Wnt1，Wnt3a，Wnt8等。Wnt受體包括十個(gè)七次跨膜的Frizzled(Fzd)受體家族和共受體LRP-5和LRP-6。當(dāng)配體受體結(jié)合后，Wnt信號(hào)被活化，通過一系列復(fù)雜過程，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，決定細(xì)胞增殖、存活、改變細(xì)胞命運(yùn)。大量文獻(xiàn)報(bào)道，Notch信號(hào)通路與Wnt信號(hào)通路之間存在著相互調(diào)節(jié)，而在DC發(fā)育分

7、化過程中，Notch信號(hào)做為Wnt信號(hào)的上游信號(hào)調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)的活化狀態(tài)，兩者在調(diào)節(jié)DC發(fā)育分化過程中發(fā)揮了重要作用。
　　我們前期研究發(fā)現(xiàn)，RBP-J介導(dǎo)的Notch信號(hào)在LPS誘導(dǎo)的DC成熟過程中發(fā)揮了十分關(guān)鍵的作用。為了進(jìn)一步探索Notch信號(hào)是否參與了DC介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，我們建立了RBP-J敲除的DC和不同腫瘤細(xì)胞共注射的小鼠荷瘤模型，觀察不同腫瘤在小鼠體內(nèi)的生長情況，對(duì)其免疫水平進(jìn)行分析，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討。明確了

8、Notch信號(hào)缺失對(duì)DC依賴的抗腫瘤免疫功能的影響并分析了其可能的分子機(jī)制。為更加有效的進(jìn)行以DC為基礎(chǔ)的抗腫瘤免疫治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論支持。本課題主要研究成果如下：
　　1、腫瘤組織浸潤的DC內(nèi)部Notch信號(hào)發(fā)生改變。
　　將B16黑色素瘤細(xì)胞按照5×106的數(shù)量接種于WTC57BL/6小鼠腹部皮下，對(duì)照小鼠皮下注射PBS，10d后處死小鼠，取荷瘤小鼠和對(duì)照小鼠脾臟，用磁珠陽性分選CD11c+DC。Real-t

9、imePCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Notch受體（Notch1，2，3）及下游基因（HES1，5）的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照小鼠DC，荷瘤小鼠DC內(nèi)部Notch受體及下游基因的表達(dá)發(fā)生了顯著改變。說明腫瘤進(jìn)展對(duì)機(jī)體免疫環(huán)境的抑制可能有Notch信號(hào)的參與。
　　2、獲得條件性RBP-J敲除轉(zhuǎn)基因鼠，篩選可皮下接種的腫瘤細(xì)胞系，確定腫瘤細(xì)胞接種數(shù)量和接種后觀察時(shí)間。
　　通過飼養(yǎng)RBP-Jflox/WT和Mx-Cre小鼠，獲得了大量

10、Mx-Cre-RBP-Jflox/WT(RBP-J-/+)和Mx-Cre-RBP-Jflox/flox(RBP-J-/-)小鼠，經(jīng)polyI:C腹腔注射誘導(dǎo)12次后得到RBP-J敲除小鼠。經(jīng)過不同腫瘤接種數(shù)量預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定腫瘤細(xì)胞接種數(shù)量為5×106。預(yù)實(shí)驗(yàn)中一共選用了九種小鼠源性腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行WTC57BL/6小鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)，包括B16黑色素瘤、H22肝癌、S180骨肉瘤、LLC肺癌、L1210白血病、EL4淋巴瘤、CT26結(jié)腸癌、M

11、FC前胃癌、EMT6乳腺癌，其中，只有前四種腫瘤細(xì)胞能在皮下成功荷瘤。同時(shí)確定了腫瘤觀察時(shí)間為腫瘤皮下注射后5d開始測(cè)量，每隔一天測(cè)量一次，至17d處死小鼠進(jìn)行分析。
　　3、Notch信號(hào)缺失的DC抗腫瘤免疫功能顯著下降。
　　用磁珠分選RBP-J-/+和RBP-J-/-小鼠DC，用腫瘤抗原負(fù)載12h，然后將1×106DC與5×106腫瘤細(xì)胞混合注射于WTC57BL/6小鼠腹部皮下，觀察腫瘤生長。發(fā)現(xiàn)含有RBP-J-/-D

12、C的腫瘤在皮下生長速度明顯快于其對(duì)照。對(duì)腫瘤組織內(nèi)部浸潤的免疫細(xì)胞成分進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，含有RBP-J-/-DC的腫瘤組織內(nèi)部浸潤的T、B、NK細(xì)胞的數(shù)量要顯著低于對(duì)照。說明DC內(nèi)Notch信號(hào)的缺失損傷了其抗腫瘤免疫功能，且不能有效的募集免疫細(xì)胞向腫瘤組織內(nèi)部浸潤。
　　4、Notch信號(hào)缺失抑制了DC成熟、降低了其遷移能力、損傷了其對(duì)T細(xì)胞的活化能力。
　　與RBP-J-/+DC相比，RBP-J-/-DC的吞噬功能并沒有顯著

13、改變。腫瘤抗原刺激后，RBP-J-/-DC表面MHCII、CD80、CD86的表達(dá)水平顯著低于其對(duì)照。其表面趨化因子受體CCR7的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照，且其向引流淋巴結(jié)的遷移能力顯著降低。在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)，其活化初始T細(xì)胞的能力減弱，其可能是由于DC-T細(xì)胞之間IS形成障礙所致。因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)DC-T接觸部位CTx和MHCII表達(dá)強(qiáng)度減弱，且DC內(nèi)部T細(xì)胞側(cè)F-actin、α-tubulin、Vinculin的極化程度顯著減低。此外

14、，體內(nèi)和體外的殺傷實(shí)驗(yàn)表明，RBP-J-/-DC活化的CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力也顯著低于對(duì)照。這些結(jié)果說明，Notch信號(hào)缺失可能通過阻礙DC成熟、降低其遷移能力和T細(xì)胞活化能力而導(dǎo)致其抗腫瘤免疫功能障礙。
　　5、Notch信號(hào)缺失導(dǎo)致DC內(nèi)Wnt受體表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平降低。
　　我們用Real-timePCR檢測(cè)了RBP-J-/+和RBP-J-/-DCWnt受體（Fzd2，4，6，8，10）mRNA表達(dá)水平，發(fā)

15、現(xiàn)，絕大多數(shù)Wnt受體在RBP-J-/-DC的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照。LPS刺激后RBP-J-/-DC內(nèi)游離鈣離子水平顯著低于對(duì)照。提示，Notch信號(hào)缺失可能通過下調(diào)Wnt/calcium信號(hào)通路，導(dǎo)致DC功能受損。
　　6、結(jié)論
　　通過本課題研究，發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)可能參與了腫瘤進(jìn)展對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的抑制。Notch信號(hào)敲除可以嚴(yán)重?fù)p傷DC在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤免疫功能，導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)浸潤的T、B、NK細(xì)胞數(shù)目顯著降低，最終導(dǎo)

16、致其不能有效抑制腫瘤生長。
　　進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)缺失阻礙了腫瘤抗原刺激后DC表面MHCII、CD80、CD86的上調(diào)，降低了趨化因子受體CCR7的表達(dá)，減少了其向引流淋巴結(jié)的遷移，削弱了其與T細(xì)胞間IS的形成，減弱了其對(duì)初始T細(xì)胞的活化。
　　深入機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)缺失很有可能是通過下調(diào)Wnt受體Fzd家族的表達(dá)，降低了Wnt/calcium信號(hào)通路的活化水平，進(jìn)而降低了DC內(nèi)游離鈣離子水平，最終通過