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文檔簡介
1、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)感染PK-15細(xì)胞后,其復(fù)制產(chǎn)生的正鏈RNA能夠被細(xì)胞質(zhì)中的模式識別受體MDA5識別。MDA5招募下游接頭蛋白VISA,VISA不僅能夠與TRAF6相互作用,通過IKK復(fù)合物磷酸化修飾I?B?,使其與NF-?B分離后被降解,NF-?B轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中;VISA而且能夠招募MITA,與蛋白激酶TBK1相互作用,從而磷酸化修飾IRF3,磷酸化的IRF3通過形成二
2、聚體,從而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。進(jìn)入細(xì)胞核的NF-?B和IRF3誘導(dǎo)細(xì)胞中I型干擾素(IFNs)和多種ISGs等抗病毒因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),引起抗病毒天然免疫反應(yīng)。
ESD的酶活性與很多疾病的發(fā)生密切相關(guān),然而,ESD參與調(diào)控天然免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo),發(fā)揮抗病毒作用的機(jī)制目前還沒有相關(guān)報道。課題組前期轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)結(jié)果表明,F(xiàn)MDV感染PK-15細(xì)胞后,ESD的轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)顯著上調(diào),表明ESD與FMDV的感染存在一定關(guān)聯(lián)。在本研究中,我們通過病
3、毒感染實(shí)驗發(fā)現(xiàn),隨著FMDV在PK-15細(xì)胞中感染時間的延伸,ESD的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均顯著上調(diào)。我們進(jìn)一步擴(kuò)增了豬的ESD基因,構(gòu)建了豬ESD基因的真核表達(dá)質(zhì)粒。在PK-15細(xì)胞中過表達(dá)ESD蛋白后接種FMDV,發(fā)現(xiàn)FMDV的復(fù)制水平顯著下降,且呈劑量依賴性。同時借助siRNA干擾技術(shù),下調(diào)表達(dá)PK-15細(xì)胞中的內(nèi)源性ESD蛋白,然后接種FMDV,發(fā)現(xiàn)FMDV的復(fù)制水平顯著上升。通過過表達(dá)和干擾實(shí)驗,我們證實(shí)了ESD能夠抑制FMDV
4、的復(fù)制。
為了進(jìn)一步探究ESD抑制FMDV復(fù)制的分子機(jī)制,我們檢測了病毒感染過程中ESD蛋白對I型干擾素信號通路下游多個抗病毒干擾素刺激基因(ISGs)表達(dá)的影響,結(jié)果表明:過表達(dá)或下調(diào)表達(dá)ESD,F(xiàn)MDV誘導(dǎo)的ISG15,MX1,ISG54,RIG-I,PKR和GBP1的mRNA表達(dá)水平也呈相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào)變化。為探究ESD是否能夠調(diào)控I型干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo),我們開展了IFN-β啟動子熒光素酶報告實(shí)驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ESD能夠促進(jìn)Se
5、V誘導(dǎo)的IFN-β的激活,并呈劑量依賴性。為進(jìn)一步揭示 ESD如何調(diào)控 I型干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo),我們開展了 I型干擾素通路分子過表達(dá)激活I(lǐng)FN-β啟動子熒光素酶報告系統(tǒng)實(shí)驗,結(jié)果表明 ESD能夠提高 IRF3以及它的上游信號分子(RIG-I-CARD,MDA5,VISA和TBK1)誘導(dǎo)的IFN-β的激活,但不影響IRF7誘導(dǎo)的IFN-β的激活,因此,我們推測ESD可能通過靶向IRF3來增強(qiáng)I型干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。為證實(shí)ESD是否影響IRF3介導(dǎo)
6、的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),我們又從蛋白水平上分別檢測了MDA5,VISA,TBK1,p-TBK1,IRF3, p-IRF3和病毒蛋白表達(dá)變化,結(jié)果表明:過表達(dá)ESD后,VISA,TBK1和IRF3表達(dá)水平變化不明顯,p-IRF3表達(dá)水平升高,F(xiàn)MDV復(fù)制水平下降;下調(diào)表達(dá) ESD后,VISA,TBK1和 IRF3表達(dá)水平變化不明顯,p-IRF3表達(dá)水平減少,F(xiàn)MDV復(fù)制水平上升。這些結(jié)果表明ESD蛋白通過增強(qiáng)IRF3的磷酸化水平來促進(jìn)I型干擾素信號轉(zhuǎn)
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