利用ZFN技術(shù)制備?？谔阋卟《臼荏w整合素β6基因敲除的核供體細(xì)胞系.pdf

1、口蹄疫（FMD）是由FMD病毒（FMDV）引起的牛、豬、羊等偶蹄動(dòng)物發(fā)生的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，國(guó)際獸醫(yī)局將其列為“A類烈性傳染病”之首，一旦爆發(fā)，必須捕殺感染及接觸感染的動(dòng)物，不僅造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的發(fā)展。
　　目前，大多數(shù)流行FMD的國(guó)家以疫苗免疫為主的措施預(yù)防FMD。然而，F(xiàn)MDV具有7個(gè)血清型且變異快，不同血清型疫苗之間沒有交叉免疫保護(hù)反應(yīng)，故通過疫苗單一手段很難控制和根除FMD，因此科學(xué)家

2、們?cè)谧⒅匾呙缪邪l(fā)的同時(shí)，開始關(guān)注病毒和宿主之間的關(guān)系，尤其是病毒受體在病毒感染過程中的作用，期望通過敲除或沉默病毒的關(guān)鍵受體阻斷病毒的感染，進(jìn)而達(dá)到控制和根除FMD的目的。
　　研究表明，整聯(lián)蛋白（Integrin)αvβ6是FMDV感染并致病的最重要的病毒受體，它可與所有血清型的FMDV結(jié)合。敲除整聯(lián)蛋白通用亞基αv基因的轉(zhuǎn)基因小鼠死胎率高、生長(zhǎng)發(fā)育異常且易發(fā)生腫瘤，因此，αv基因不是抗FMD研究的理想受體基因；β6是啟動(dòng)FMD

3、V強(qiáng)毒感染的決定性受體亞基，敲除整聯(lián)蛋白β6亞基基因的轉(zhuǎn)基因小鼠生長(zhǎng)發(fā)育正常。因此，敲除整聯(lián)蛋白β6亞基是阻斷病毒感染的關(guān)鍵途徑，為研制控制和根除FMD的藥物提供靶點(diǎn)。傳統(tǒng)的基因打靶效率低，周期長(zhǎng)。因此，近年來人們不斷嘗試發(fā)現(xiàn)新的基因打靶技術(shù)并應(yīng)用于基因研究中，其中，鋅指核酸酶技術(shù)已經(jīng)成為基因打靶的一個(gè)高效、有力的工具,可在細(xì)胞和個(gè)體水平上進(jìn)行基因操作，并成功應(yīng)用于多種動(dòng)物的基因修飾。
　　本研究采用手術(shù)方法取出45日齡的荷斯坦奶

4、牛胎兒，利用膠原酶IV消化法，培養(yǎng)了原代奶牛胎兒成纖維細(xì)胞系，并對(duì)其 F0及 F1代進(jìn)行了大量?jī)龃?，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)的使用。
　　根據(jù)NCBI上公布的牛整合素β6基因序列設(shè)計(jì)引物，以實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)的原代奶牛胎兒成纖維細(xì)胞的DNA為模板，擴(kuò)增β6基因，并進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交SIGMA公司，定制針對(duì)integrinβ6亞基基因的鋅指核酸酶。對(duì)電轉(zhuǎn)染的程序進(jìn)行優(yōu)化，最終選擇U-023作為電轉(zhuǎn)染原代奶牛胎兒成纖維細(xì)胞的程序，ZFNs采用此程

5、序電轉(zhuǎn)染原代奶牛胎兒成纖維細(xì)胞，T-A克隆、DNA測(cè)序并與野生型序列進(jìn)行比對(duì)，確定切割位點(diǎn)發(fā)生突變的細(xì)菌克隆數(shù)，突變數(shù)/送測(cè)總數(shù)就是ZFN針對(duì)靶DNA切割的打靶效率，約為22.9％，有限稀釋法制備單克隆細(xì)胞，克隆環(huán)挑取細(xì)胞克隆并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，按打靶效率檢測(cè)方法進(jìn)行鑒定，獲得陽性細(xì)胞克隆25個(gè)，其基因突變類型分為三種：基因的添加（2/25，8%）包含1個(gè)純合子一個(gè)雜合子、敲除(17/25，68%)包含8個(gè)純合子和9個(gè)雜合子及混合細(xì)胞克?。?/p>

6、6/25，24%）包含6個(gè)雜合子。
　　針對(duì)ZFNs切割位點(diǎn)設(shè)計(jì)了含有無啟動(dòng)子的GFP基因的同源打靶載體pβ6LNGR，線性化同源打靶載體并與ZFNs共轉(zhuǎn)染原代奶牛小腸上皮細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下觀察到GFP的表達(dá)，初步驗(yàn)證ZFNs介導(dǎo)發(fā)生同源重組，單轉(zhuǎn)線性化的pβ6LNGR質(zhì)粒，未觀察到GFP表達(dá)。隨后兩者共轉(zhuǎn)染原代奶牛成纖維細(xì)胞，經(jīng)G418篩選10天，挑取克隆，PCR方法進(jìn)行鑒定，獲得陽性細(xì)胞克隆10個(gè)，其中1個(gè)純合子9個(gè)雜合子