慢病毒介導shRNA穩(wěn)定持續(xù)抑制口蹄疫病毒增殖的兩類細胞系的建立.pdf

1、RNA干擾(RNAi)是廣泛存在于生物界的一種由內源性或外源性雙鏈RNA分子誘發(fā)的同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象,是許多生物具有的對抗入侵的核酸,保護自身的天然機制。誘發(fā)RNAi的最關鍵分子是長度為19～27bp的雙鏈RNA,被稱為小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)。隨著RNAi機制及其應用研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)無論體內還是體外試驗,siRNA均能夠抑制多種病毒的增殖。近年來,許多學者以人工誘導R

2、NAi的方式進行了病毒復制的干擾研究,取得了良好進展,因此RNAi技術被認為是最有應用價值的抗病毒感染方法之一。
　　 口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的多種偶蹄動物共患的急性傳染病,被國際獸疫局列為A類傳染病之首。由于口蹄疫病毒非常容易發(fā)生變異,導致新的變異株不斷出現(xiàn)、更迭,傳統(tǒng)的疫苗免疫等措施不能有效地應對口蹄疫的爆發(fā)和流行。RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及其在抗病毒方面的研究進展,為FMD的防制研究開辟了一個新的探索領域。本研究針對口蹄疫病毒

3、的體外復制進行了RNA干擾的成功探索。FMDV的2B和3D基因在FMDV不同血清型和亞型中非常保守,根據(jù)美國Invitrogen公司提供的siRNA在線設計結果,針對2B和3D區(qū)段設計并合成了5個shRNA模板,同時設計了一個無關對照shRNA模板,分別克隆到shRNA表達載體的U6啟動子下游,構建了6個相應的shRNA表達質粒。
　　 首先,從細胞水平研究了shRNA表達載體對3D基因表達的抑制作用,將3D基因克隆到真核表達載

4、體pEGFP-N1中,獲得重組的融合表達質粒pEGFP+3D。將針對3D基因的4個干擾質粒分別與pEGFP+3D共轉染PK-15細胞,經(jīng)熒光顯微鏡觀察、流式細胞儀和real-time RT-PCR分析,表明pEN／U6-3D1、pEN／U6-3D2、pEN／U6-3D3和pEN／U6-3D4對3D基因的表達有一定的抑制作用,其中pEN／U6-3D2和pEN／U6-3D4的效果較為突出。
　　 然后將pEN／U6-3D2,pEN／

5、U6-3D4,pEN／U6-2B和pEN／U6-CON進行LR重組生成對應的pEX／U6-3D2,pEX／U6-3D4,pEX／U6-2B和pEX／U6-CON。接著將重組后的表達載體在轉染試劑介導下和輔助質粒一同轉染293FT細胞,在轉染后50h時收獲慢病毒。將上述慢病毒轉染原代羊胚胎成纖維細胞和PK-15細胞,48h時換成帶有抗性的培養(yǎng)液進行篩選,14天左右的時間獲得單克隆細胞株,擴大培養(yǎng)后保存各細胞株,其中FMDV特異性shRNA