慢病毒介導(dǎo)的shRNA通過(guò)干擾microRNA表達(dá)譜非特異抑制丙型肝炎病毒增殖的研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)感染引起的丙型病毒性肝炎及誘發(fā)的肝硬化、肝癌等疾病已嚴(yán)重威脅到人類(lèi)健康，缺乏相應(yīng)的疫苗和抗病毒藥物的局限性是控制HCV感染和治療相關(guān)疾病的主要障礙。HCV主要依賴于宿主因子完成病毒的入侵、復(fù)制、組裝和釋放，因此找出與HCV相互作用的宿主因子有助于闡明HCV的感染過(guò)程和宿主應(yīng)答的分子機(jī)制，同時(shí)對(duì)發(fā)現(xiàn)新的抗病毒治療的藥物靶標(biāo)和研制有效的HCV疫苗有著重要的理論和實(shí)際意義。
　　

2、HCV感染能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生自噬，HCV復(fù)制的起始依賴于自噬相關(guān)蛋白，而且HCV誘導(dǎo)的自噬通過(guò)抑制宿主細(xì)胞天然免疫應(yīng)答進(jìn)而促進(jìn)HCV的復(fù)制。但是HCV利用自噬進(jìn)行自身復(fù)制的具體分子機(jī)制目前仍不清楚。本課題組在篩選與HCV誘導(dǎo)自噬相關(guān)的宿主因子時(shí)，發(fā)現(xiàn)荷電多囊體蛋白4B(charged multivesicularbody protein4B，CHMP4B)表達(dá)升高。CHMP4B作為轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)涵體分選復(fù)合物-Ⅲ(endosomal sor

3、ting complex required for transport-Ⅲ，ESCRT-Ⅲ)的重要組成部分，參與細(xì)胞分裂，調(diào)節(jié)自噬，同時(shí)還參與HCV病毒顆粒的釋放。但是，CHMP4B調(diào)節(jié)自噬和影響HCV病毒顆粒釋放的具體分子機(jī)制不明。因此，本研究擬解決的第一個(gè)問(wèn)題是:CHMP4B在HCV感染中發(fā)揮的作用是什么？本研究利用慢病毒介導(dǎo)的shRNA敲低CHMP4B，通過(guò)Westem Blot和Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，瞬時(shí)敲低CHM

4、P4B導(dǎo)致宿主細(xì)胞內(nèi)HCV蛋白水平下降而HCVRNA水平不變。為進(jìn)一步研究CHMP4B通過(guò)與哪些宿主蛋白相互作用從而影響HCV蛋白表達(dá)，我們擬利用串聯(lián)親和純化（tandem affinity purification，TAP）技術(shù)篩選HCV感染時(shí)與CHMP4B相互作用的宿主蛋白。為此，我們利用慢病毒介導(dǎo)的shRNA構(gòu)建了CHMP4B穩(wěn)定敲低的Huh7.5細(xì)胞系，擬通過(guò)外源表達(dá)與內(nèi)源表達(dá)水平相當(dāng)?shù)膸Ъ兓瘶?biāo)簽的CHMP4B進(jìn)行串聯(lián)親和純化以

5、獲得與CHMP4B相互作用蛋白。
　　然而，我們通過(guò)Western Blot和Real-time PCR發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)CHMP4B shRNA和無(wú)靶標(biāo)對(duì)照shRNA時(shí)Huh7.5細(xì)胞胞內(nèi)HCV蛋白和RNA水平均明顯下降，而瞬時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)無(wú)靶標(biāo)對(duì)照shRNA胞內(nèi)HCV蛋白和RNA水平無(wú)明顯變化，提示shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)可能誘導(dǎo)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)抑制HCV的增殖。因此，本研究針對(duì)shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)的這種非特異性脫靶效應(yīng)的機(jī)制進(jìn)行了深入研究。為了

6、驗(yàn)證脫靶效應(yīng)是不是由于激活天然免疫應(yīng)答所致，首先，我們通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)HCV感染后shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中IFN-β啟動(dòng)子的活性，發(fā)現(xiàn)IFN-β啟動(dòng)子活性無(wú)明顯變化，提示脫靶效應(yīng)并非通過(guò)激活Ⅰ型干擾素通路誘導(dǎo)產(chǎn)生;其次，我們通過(guò)Real-time PCR方法檢測(cè)shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞上清處理Huh7.5細(xì)胞后胞內(nèi)HCVRNA的變化，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)HCV RNA的含量無(wú)明顯變化，提示脫靶效應(yīng)也不依賴于抗病毒因子的產(chǎn)生。瞬時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)shR

7、NA高水平表達(dá)會(huì)通過(guò)干擾宿主miRNA從而抑制HCV復(fù)制，提示shRNA的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)可能也干擾miRNA的表達(dá)從而抑制HCV復(fù)制，因此本研究用miRNA芯片檢測(cè)了shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜發(fā)生顯著變化，提示脫靶效應(yīng)的產(chǎn)生可能與miRNA表達(dá)譜的變化相關(guān)。對(duì)miRNA表達(dá)譜進(jìn)一步分析表明，低水平的shRNA穩(wěn)定表達(dá)即可影響宿主miRNA的表達(dá)，進(jìn)而影響HCV增殖。另外，shRNA整合位點(diǎn)也可

8、能影響miRNA表達(dá)譜的變化，進(jìn)而影響HCV的增殖。miRNA表達(dá)譜中有60個(gè)miRNA表達(dá)水平有兩倍以上的變化，其中三個(gè)miRNA文獻(xiàn)已報(bào)道參與HCV感染的調(diào)控:miR-196a、miR-491和miR-149。為進(jìn)一步驗(yàn)證是不是miRNA表達(dá)譜的變化影響了HCV的增殖，除上述3個(gè)miRNA外，本研究還挑選了變化倍數(shù)較大且與上述miRNA變化趨勢(shì)一致的4個(gè)miRNA: miR-1246、miR-193、miR-744和miR-769，

9、通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染相應(yīng)miRNA mimic和inhibitor后HCV增殖的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-196a或敲低miR-491均抑制HCV的增殖，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，miR-149對(duì)HCV增殖無(wú)影響，也與文獻(xiàn)報(bào)道其參與調(diào)控HCV入侵一致;過(guò)表達(dá)miR-1246抑制HCV增殖，而miR-744、miR-193和miR-769對(duì)HCV增殖無(wú)影響。上述結(jié)果提示，慢病毒介導(dǎo)的shRNA通過(guò)干擾miRNA表達(dá)譜非特異性抑