慢病毒介導(dǎo)YAP基因過表達(dá)促miPSC-ECs增殖的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文對(duì)慢病毒介導(dǎo)YAP基因過表達(dá)促miPSC-ECs增殖進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：miPSC-ECs的建立及YAP基因重組慢病毒載體pPGK-2Flag-YAP2-Puro的構(gòu)建。
　　目的：建立小鼠誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞來源的內(nèi)皮細(xì)胞（Mouse induced pluripotent stem cells-Endothelial cells,miPSC-ECs）；構(gòu)建Yes相關(guān)蛋白（Yes-assoc

2、iated protein,YAP）重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒并行慢病毒包裝。
　　方法：誘導(dǎo)miPSCs分化為ECs(miPSC-ECs)；對(duì)miPSC-ECs進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定及形態(tài)學(xué)觀察。從模板質(zhì)粒（pCMV-Flag-YAP2-5SA）中獲取目的基因YAP2并擴(kuò)增，將其cDNA亞克隆至穿梭質(zhì)粒pPGK-iRFP-IRES-Puro，構(gòu)建重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒（pPGK-2Flag-YAP2-Puro）；將pPGK-2Flag-YAP2-P

3、uro和輔助包裝元件共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞行慢病毒包裝。
　　結(jié)果：miPSCs誘導(dǎo)分化所得細(xì)胞第3天形態(tài)呈條索狀、扁平、梭形，兩端有突起，符合 ECs形態(tài)學(xué)特征；細(xì)胞免疫熒光染色后miPSCs誘導(dǎo)分化所得細(xì)胞表達(dá) CD31。重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒（pPGK-2Flag-YAP2-Puro）構(gòu)建成功，YAP基因過表達(dá)慢病毒包裝成功，滴度達(dá)到1.2×109TU/ml。
　　結(jié)論：成功獲得miPSC-ECs；成功構(gòu)建YAP基因慢病毒過

4、表達(dá)載體。
　　第二部分：慢病毒介導(dǎo)YAP基因體外感染miPSC-ECs及其促增殖的實(shí)驗(yàn)研究。
　　目的：將構(gòu)建好的YAP基因慢病毒過表達(dá)載體感染miPSC-ECs，建立過表達(dá)YAP基因的細(xì)胞株miPSC-ECs/YAP；研究過表達(dá)YAP基因?qū)iPSC-ECs內(nèi)磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（Phoshoinositide-3-kinase/Protein Kinase B，PI3K/Akt）信號(hào)通路的活化作用，以及對(duì)mi

5、PSC-ECs增殖的影響。
　　方法：慢病毒包裝重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒（pPGK-2Flag-YAP2-Puro），并感染miPSC-ECs。嘌呤霉素（Puromycin）篩選穩(wěn)定感染的細(xì)胞miPSC-ECs/YAP，并用RT-PCR及Western blot方法驗(yàn)證。MTT比色法檢測(cè)過表達(dá)YAP對(duì)miPSC-ECs增殖的影響。Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染YAP后miPSC-ECs內(nèi)PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白PTEN、P

6、-Akt以及Pan-Akt的表達(dá)。
　　結(jié)果：轉(zhuǎn)染YAP的miPSC-ECs中YAP mRNA表達(dá)水平較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞明顯升高，YAP蛋白高表達(dá)（未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中YAP蛋白幾乎不表達(dá)）。轉(zhuǎn)染YAP的miPSC-ECs較未轉(zhuǎn)染YAP的miPSC-ECs增殖速度明顯加快。同步化之后24小時(shí)（0.113±0.004 vs0.077±0.004，P<0.01）、48小時(shí)（0.368±0.010 vs0.199±0.006，P<0.01）、72小時(shí)

7、（0.716±0.004vs0.418±0.018，P<0.01），miPSC-ECs/YAP組MTT光密度值(OD值)較未轉(zhuǎn)染組顯著增加。miPSC-ECs/YAP組較未轉(zhuǎn)染組人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)/GAPDH比值明顯降低（0.63±0.02 vs0.88±0.03，P<0.05），磷酸化AKT(Phos