慢病毒介導(dǎo)XAF1基因抑制肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:研究腫瘤抑制基因XAF1在肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的作用,為基因治療肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:本研究利用慢病毒為載體將XAF1基因轉(zhuǎn)染入肺腺癌A549細(xì)胞株,采用Blasticidin進(jìn)行篩選,建立穩(wěn)定高表達(dá)XAF1基因細(xì)胞株A549后,分別應(yīng)用PCR、western blot及免疫熒光法檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中XAF1的表達(dá);應(yīng)用遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株遷移和侵襲的能力;通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及蛋白印跡

2、法(Western Blot)分別檢測XAF1和MTA1基因mRNA和蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用裸鼠肺癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移瘤模型,研究XAF1穩(wěn)定高表達(dá)抑制肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的作用及評價其治療的安全性,并應(yīng)用免疫組化法檢測裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤組織及人體肺癌組織標(biāo)本中XAF1及MTA1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:穩(wěn)定高表達(dá)XAF1基因的肺癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建成功后,顯著抑制了肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力,減少了肺癌細(xì)胞穿過小室空隙的數(shù)量。XAF1基因穩(wěn)定高表達(dá)對A549

3、細(xì)胞MTA1基因mRNA表達(dá)未有顯著影響,但卻明顯下調(diào)了MTA1蛋白的表達(dá),考慮與蛋白泛素化有關(guān),利用泛素化酶體抑制劑作用于肺癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,發(fā)現(xiàn)A549/XAF1細(xì)胞中的泛素化酶體被抑制后,MTA1蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng),說明XAF1是通過蛋白質(zhì)泛素化途徑調(diào)節(jié)MTA1蛋白的表達(dá)。在體內(nèi),XAF1穩(wěn)定高表達(dá)可顯著抑制裸鼠肺癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移瘤形成,降低移植瘤組織中MTA1的表達(dá),并未見裸鼠全身主要臟器明顯損害。在人體肺癌組織中,利用免疫組化法檢