慢病毒介導(dǎo)survivin體外轉(zhuǎn)染MSCs實驗研究.pdf

1、目的：單純未轉(zhuǎn)染干細(xì)胞移植體內(nèi)后生存能力低下嚴(yán)重限制了其增殖能力。本研究旨在探討存活素(Survivin,Svv)基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在離體微環(huán)境中延長生存能力的機(jī)制,為新的干細(xì)胞抗凋亡移植策略提供理論依據(jù)。
　　 方法：分離提取幼年C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞,采用全骨髓法培養(yǎng)擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,取第11代細(xì)胞進(jìn)行試驗。未轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)計數(shù)并繪制生長曲線;同時應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物SCA-1

2、、CD29、CD34、CD44和CD117;行成骨、成脂誘導(dǎo)分化測定;rt-PCR測定細(xì)胞內(nèi)survivin表達(dá)情況。制備DNA-Lipofectamine2000復(fù)合物,同時轉(zhuǎn)染到293FT細(xì)胞中收集含有病毒的培養(yǎng)液,制備Svv重組慢病毒和空白對照病毒,測定病毒滴度;Svv慢病毒和空白病毒分別轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并測出轉(zhuǎn)染率接近大于90％時的MOI值;分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染后成骨誘導(dǎo)分化測定;并運(yùn)用rt-PCR比較轉(zhuǎn)染前后間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)surv

3、ivin表達(dá)變化情況。
　　 結(jié)果：培養(yǎng)出的細(xì)胞呈長梭成纖維細(xì)胞樣,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面高表達(dá)SCA-1、CD29、CD34、CD44,低表達(dá)CD117;細(xì)胞曲線顯示傳代細(xì)胞培養(yǎng)第1-3 d生長緩慢,第4 d生長加快并在第7 d達(dá)到高峰;成骨誘導(dǎo)20 d經(jīng)茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié),成脂誘導(dǎo)14 d油紅O染色顯示有大量脂質(zhì)沉淀;rt-PCR結(jié)果顯示survivin mRNA陽性表達(dá)。成功包裝出Svv慢病毒和空白病毒,實驗組病毒滴度

4、為7.1×107TU/ml,空白病毒組病毒滴度為8.3×107 TU/ml;轉(zhuǎn)染率接近大于90%時的MOI值Svv慢病毒和空白病毒分別為28.4和8.3;轉(zhuǎn)染后的Svv慢病毒和空白病毒均能向成骨分化;同時rt-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后明顯過表達(dá)survivin。
　　 結(jié)論：全骨髓培養(yǎng)法可以培養(yǎng)出大量骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,同時survivin在小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中正常表達(dá),提示可能參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抗凋亡過程;慢病毒轉(zhuǎn)然后骨髓間充質(zhì)