慢病毒介導MMP-3shRNA和Fas-siRNA體外轉染人退變髓核細胞的生物學效應.pdf

1、目的：通過慢病毒介導MMP-3shRNA和Fas-siRNA雙基因體外轉染人退變髓核細胞，探討單基因、雙基因聯(lián)合轉染后對人退變髓核細胞功能的影響。
　　方法：a.體外培養(yǎng)人退變髓核細胞，對其進行臺盼藍染色、甲苯胺藍染色，觀察細胞活力以及細胞形態(tài)；b.分別根據(jù)人MMP-3基因與Fas基因的mRNA序列合成不同的MMP-3 shRNA與Fas-siRNA序列，與酶切后的慢載體鏈接并轉入感受態(tài)293T細胞，對慢病毒進行包裝。c.慢病毒感

2、染退變髓核細胞，按照處理方式不同，本實驗分為5組，分別為：A-空白對照組，B-AAV陰性對照組，C-AAV-MMP-3shRNA組，D-AAV-FassiRNA組，E-AAV-FassiRNA-MMP3shRNA組；d.轉染72小時后CCK8測定各組之間的細胞增殖情況；72小時通過熒光定量 PCR檢測轉染髓核細胞mRNA水平變化(MMP-3、Fas以及Ⅱ型膠原、蛋白多糖)；96小時后通過Western Blot檢測髓核細胞內蛋白水平變化

3、（Ⅱ型膠原蛋白、蛋白多糖）。
　　結果：a.細胞形態(tài)學進行觀察發(fā)現(xiàn)初消化的成人退變髓核細胞貼壁時間約為4-5天，初貼壁時的形態(tài)表現(xiàn)為橢圓形、梭形、多角形，形狀不規(guī)則，胞質向外伸突并隨著時間延長逐漸伸長。經10-14 d以后，90%細胞呈融合狀態(tài)，形狀類似漩渦狀或火焰狀的細胞團，胞質豐富且?guī)в幸欢ㄕ酃庑?，細胞核較大輪廓清楚，呈卵圓形核，有大約1-3個核仁。經過傳代后，第一代細胞之間的粘附性較原代變差，細胞形態(tài)變?yōu)殚L梭形，這與之前的研

4、究相一致原代髓核細胞經甲苯胺藍染色后呈短梭形、多角形等不規(guī)則形狀，胞質均呈藍色，細胞核位于細胞中央或偏向一側細胞膜，顏色較周圍胞質深。b.退變髓核細胞原代培養(yǎng)期間存活率在97%以上，第1代培養(yǎng)期間存活率在92-96%之間，第二代仍能維持90%左右,以后細胞存活率逐漸下降。c.72小時后用熒光顯微鏡檢測重組慢病毒侵染人退變髓核細胞后的GFP、BFP表達情況，結果顯示各組退變髓核細胞均已達到很高的轉染效果。d.與空白對照組相比較，F(xiàn)as干擾

5、組、MMP3干擾組及MMP3+Fas雙基因共轉組Fas、MMP-3、II型膠原、蛋白多糖的mRNA表達量增加，且雙基因組效果優(yōu)于單基因組，與空白對照組相比較，F(xiàn)as干擾組、MMP3干擾組及MMP3+Fas雙基因共轉組髓核細胞的蛋白多糖和Ⅱ型膠原蛋白表達量增高，且雙基因組效果優(yōu)于單基因組，以上結果差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結論：1.通過基因沉默技術干擾髓核細胞內Fas、MMP-3基因的表達，可以有效抑制髓核細胞的凋