慢病毒介導IL-1Ra基因?qū)θ嘶ぜ毎w外轉(zhuǎn)染的研究.pdf

1、目的骨性關(guān)節(jié)炎(OA)是影響中老年人正常生活的常見疾病，其發(fā)病率在60歲以上的人群中，男性為5.6％，而女性為15％，給個人和社會帶來巨大的身心和經(jīng)濟負擔。在其發(fā)病過程中，大量炎性因子的釋放無疑扮演著重要角色，如IL-1、TNF等。近年來針對這些炎性因子的生物學功能研發(fā)開啟了一系列相關(guān)的基因療法，而在這些方法中，滑膜細胞的作用越來越受到重視。滑膜細胞釋放的炎癥介質(zhì)會造成關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨基質(zhì)的降解，加重炎癥性改變，而其中IL-1Ra是最重要的一

2、種炎癥介質(zhì)。本實驗中以慢病毒(Lentivirus)介導白介素-1受體拮抗蛋白基因(IL-1Ra)對人膝關(guān)節(jié)滑膜細胞進行轉(zhuǎn)染，試圖以慢病毒介導IL-1Ra基因?qū)ぜ毎咝У霓D(zhuǎn)染效率及IL-1 Ra基因在滑膜細胞中高效穩(wěn)定的表達、分泌，實現(xiàn)對炎癥介質(zhì)IL-1的拮抗作用，從而達到抑制軟骨基質(zhì)降解的目的。
　　方法體外培養(yǎng)人膝關(guān)節(jié)滑膜細胞，以慢病毒介導IL-1Ra表達的重組質(zhì)粒對對數(shù)生長期的人滑膜細胞進行轉(zhuǎn)染，熒光顯微鏡下觀察其是否能

3、高效轉(zhuǎn)染，并通過ELISA實驗、免疫組化實驗檢測轉(zhuǎn)染的基因是否能夠有效表達，最后通過細胞周期的檢測來研究基因轉(zhuǎn)染對細胞增殖速率的影響。膝關(guān)節(jié)表面置換手術(shù)中取人體膝關(guān)節(jié)滑膜組織，無菌條件下運送至實驗室，培養(yǎng)原代滑膜細胞，經(jīng)傳代培養(yǎng)（至P2代），細胞得以純化后進行轉(zhuǎn)染試驗。將P2代細胞分為3組進行對照試驗:A組為慢病毒介導目的基因IL-1Ra進行轉(zhuǎn)染;B組為陰性對照組，以單純的空白慢病毒載體進行轉(zhuǎn)染;C組為空白對照組，只作正常的細胞培養(yǎng)。轉(zhuǎn)

4、染后72h熒光顯微鏡下觀察，以綠色光為激發(fā)光，觀察各組熒光狀態(tài)并計算轉(zhuǎn)染效率。分別收集A、B、C三組細胞轉(zhuǎn)染后72h的培養(yǎng)上清液，行ELISA實驗測定各組中IL-1Ra蛋白表達量，分析比較經(jīng)過慢病毒介導IL-1Ra基因轉(zhuǎn)染的滑膜細胞是否能夠有效分泌IL-1Ra蛋白。分別收集轉(zhuǎn)染后72h的A、B、C三組細胞種植于載玻片，置于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24h后行DAB染色，蘇木素輕度復染，顯微鏡下觀察染色情況，計算各組細胞的IL-1Ra的表達率。

5、>　　結(jié)果慢病毒介導IL-1Ra基因可高效轉(zhuǎn)染人膝關(guān)節(jié)滑膜細胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后72h的滑膜細胞綠色熒光表達強烈，轉(zhuǎn)染率約為90％。ELISA實驗測定轉(zhuǎn)染后72h的細胞培養(yǎng)上清含IL-1Ra蛋白A組為(58.723±3.156) ng/ml，B組均為(10.598±3.821)ng/ml，C組均為(11.263±6.833) ng/ml。免疫組化實驗顯示A組細胞約95％胞質(zhì)內(nèi)可清楚看到IL-1Ra蛋白顆粒的染色，B、C兩組內(nèi)幾乎看