逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的IL-1Ra和TGF-β1聯(lián)合體外轉(zhuǎn)染兔軟骨細(xì)胞表達(dá)的研究.pdf

1、第一部分重組基因PLNCX2-IL-1Ra-GFP和PLNCX-TGF-β1-RFP的構(gòu)建 目的：構(gòu)建重組基因PLNCX2-IL-1Ra-GFP和PLNCX2-TGF-β1-RFP，為基因轉(zhuǎn)染提供目的基因。 方法：載體PLNCX2經(jīng)XhoI/HindIII酶切，去磷酸化后，與載體pCDNA3.1-GFP(-)經(jīng)XhoI/HindIII雙酶切得到的多克隆位點(diǎn)和GFP基因在T4DNA連接酶的作用下連接，構(gòu)建成PLNCX2-G

2、FP。II-1Ra基因從正常人腦組織cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增，膠回收，經(jīng)XhoI/BamHIII雙酶切后，與經(jīng)XhoI/BamHIII雙酶切的PLNCX2-GFP，在T4DNA連接酶的作用下連接，構(gòu)建成PLNCX2-II-1Ra-GFP。載體經(jīng)PLNCX2 HindIII/NotI雙酶切，去磷酸化后，與載體pDsRed2經(jīng)HindIII/NotI雙酶切得到大的部分多克隆位點(diǎn)和RFP基因在T4DNA連接酶作用下連接，構(gòu)建成PLNCX2-RFP。

3、TGF-β1基因從PGEMT-TGF中擴(kuò)增，膠回收，經(jīng)XhoI/HindIII雙酶切后，與經(jīng)XhoI/HindIII雙酶切的PLNCX2-RFP在T4DNA連接酶作用下連接，構(gòu)建成PLNCX2-TGF-β1-RFP。 結(jié)果：重組基因PLNCX2-IL-1Ra-GFP和PLNCX2-TGF-β1-RFP經(jīng)酶切鑒定測(cè)序II-1Ra、TGF-β1、RFP、GFP序列均正確，基因可以通讀；并且經(jīng)酶切電泳后，其條帶位置與相應(yīng)的質(zhì)粒圖譜相符

4、。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒重組基因PLNCX2-IL-1Ra-GFP和PLNCX2-TGF-β1-RFP是正確的。 第二部分重組基因PLNCX2-IL-IRa-GFP和PLNCX2-TGF-β1-RFP的病毒包裝和滴度測(cè)定 目的：提高逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLNCX2-IL-1Ra-GFP和PLNCX2-TGF-β1-RFP的轉(zhuǎn)染效率，并測(cè)定用于轉(zhuǎn)染的最佳病毒滴度。 方法：包裝細(xì)胞PT67生長(zhǎng)至80％融合時(shí)

5、，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法分別將重組質(zhì)粒PLNCX2-II-1Ra-GFP和PLNCX2-TGF-β1-RFP轉(zhuǎn)染PT67，具體操作方法見(jiàn)真核細(xì)胞LipofectAMINE2000Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒，用G418篩選培養(yǎng)14d，待轉(zhuǎn)染細(xì)胞形成抗性克隆后挑選出擴(kuò)增培養(yǎng)、傳代、收集各克隆1～4代的病毒上清，過(guò)濾后分裝-70凍存。取6孔培養(yǎng)板，每孔加入2×104個(gè)NIH3T3細(xì)胞株，細(xì)胞生長(zhǎng)至80％融合時(shí)，加入1:100稀釋的各陽(yáng)性克隆病毒液3m

6、l，培養(yǎng)4h后換用300μg/ml的G418篩選液培養(yǎng)4周，計(jì)數(shù)存活的抗性克隆，根據(jù)公式計(jì)算病毒上清滴度。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞后，可分別看到綠色和紅色熒光；轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞后計(jì)算病毒滴渡為1×106C.F.U； 結(jié)論：得到具有高轉(zhuǎn)染效率的重組基因，并獲得最佳的轉(zhuǎn)染病毒滴度。 第三部分重組基因PLNCX2-IL-1Ra-GFP和PINCX2-TGF-β1-RFP體外轉(zhuǎn)染兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞對(duì)其生物學(xué)性狀的影響及其

7、目的基因表達(dá)情況的研究 目的：探討運(yùn)用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)白介素-1受體拮抗劑(IL-1Ra)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)，分別和共同體外轉(zhuǎn)染兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，觀察其在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的表達(dá)情況。 方法：將構(gòu)建含有目的基因的表達(dá)載體PLNCX2-IL-1Ra-GFP和PLNCX2-TGF-β1-RFP，分別和聯(lián)合體外轉(zhuǎn)染到兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，采用N0檢測(cè)試劑盒檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染對(duì)軟骨細(xì)胞的影響，及ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)

8、上清液中hIL-1Ra和hTGF-β1的表達(dá)情況。 結(jié)果：酶切和測(cè)序表明構(gòu)建成功預(yù)期的真核表達(dá)載體PLNCX2-IL-1RvGFP和PLNCX2-TGF-β1-RFP；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞后免疫熒光倒置顯微鏡分別觀察到綠色和紅色熒光，共轉(zhuǎn)染組同一細(xì)胞可見(jiàn)綠色和紅色熒光，證明轉(zhuǎn)染成功：培養(yǎng)液中NO含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)單基因轉(zhuǎn)染和聯(lián)合轉(zhuǎn)染分別為(92.15±5.36)μmol/L、(89.71±5.43)μmol/L、(94.93±4.88)μ

9、mol/L，空載體組和空白組分別為(60.19±4.68)μmol/L、(57.23±4.29)μmol/L，基因轉(zhuǎn)染組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，非基因轉(zhuǎn)染組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，基因轉(zhuǎn)染組與非基因轉(zhuǎn)染組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染組均有相應(yīng)的一定量的hIL/1Ra和hTGF-β1表達(dá)，單基因轉(zhuǎn)染組分別為(43.42±4.07)ng/L、(28.08±3.73)ng/L，聯(lián)合轉(zhuǎn)染組分別為(46.55±4.8