逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導的IL-1Ra和TGF-β1聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染治療兔膝骨關節(jié)炎的研究.pdf

1、骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種退行性關節(jié)疾病，多發(fā)于老年人群，嚴重影響了人們的生活質(zhì)量，且需消耗大量的個人及社會財力。國內(nèi)的統(tǒng)計資料表明，我國患有OA的人數(shù)占總人口的3％，其中大部分為膝OA，55歲以上人群X線有膝OA表現(xiàn)者約60％，65歲以上老年人OA的發(fā)病率可達85％，75歲以上的老年人中每人都有至少一個關節(jié)有OA變化。目前，傳統(tǒng)的藥物治療和外科手段對OA的療效有限，且無法阻止OA的進一步發(fā)展，近年來基因治療為

2、OA的防治開辟了一條新途徑，受到越來越多的重視。將功能基因片段整合到基因載體內(nèi)，再將基因載體轉(zhuǎn)染入靶細胞中或轉(zhuǎn)染入關節(jié)腔內(nèi)，通過轉(zhuǎn)基因的靶細胞持續(xù)大量分泌功能基因產(chǎn)物，在一個較長的時期保持局部治療濃度，由于OA病變主要累及少數(shù)負重關節(jié)，因此適合應用關節(jié)內(nèi)局部基因治療。在臨床應用基因治療OA之前，我們有必要在細胞實驗和動物實驗中確證哪些基因或基因的組合會對OA產(chǎn)生更好的治療效果，目前已有許多研究以表明基因療法對OA的有效性，并且多基因聯(lián)合

3、治療OA效果好于單基因，在本實驗中，我們利用重組人IL-1Ra(一種很重要的拮抗基因)和TGF—β1(一種很重要的保護基因)基因從促進軟骨基質(zhì)合成和抑制軟骨基質(zhì)降解兩個層面聯(lián)合轉(zhuǎn)染治療OA。 第一部分聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染兔膝軟骨細胞及對其增值代謝的影響 目的:觀察以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，介導白介素-1受體拮抗蛋白(IL-1Ra)基因與轉(zhuǎn)化生長因子—β1(TGF—β1)基因共轉(zhuǎn)染兔膝軟骨細胞后的表達，及對其增殖代謝的影響。 方

4、法:將體外培養(yǎng)的軟骨細胞分為空白轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組、IL-1Ra單基因轉(zhuǎn)染組、TGF—β1單基因轉(zhuǎn)染組及IL-1Ra和TGF—β1雙基因轉(zhuǎn)染組。酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)進行瞬時基因表達(細胞轉(zhuǎn)染后48h)及穩(wěn)定基因表達(篩選第4w)的檢測；免疫組織化學染色法檢測各組IL-1Ra、TGF—β1及Ⅱ型膠原的表達；流式細胞儀檢測各組細胞生長周期比例。 結果:空白組與PLNCX2空載體轉(zhuǎn)染組的上述指標差異無顯著性(P＞0.05

5、)；ELISA檢測顯示基因轉(zhuǎn)染組有明顯基因表達；與空白組及PLNCX2空載體轉(zhuǎn)染組相比，雙基因轉(zhuǎn)染組IL-1Ra、TGF—β1、Ⅱ型膠原含量明顯提高(P＜0.05)，IL-1Ra單基因轉(zhuǎn)染組IL-1Ra含量提高明顯，TGF—β1單基因轉(zhuǎn)染組TGF—β1、Ⅱ型膠原含量提高明顯；基因轉(zhuǎn)染組軟骨細胞位于S期的比例增高明顯，與空白組比較差異有顯著性(P＜0.05)。 結論:基因轉(zhuǎn)染軟骨細胞后可獲得穩(wěn)定表達，IL-1Ra+TGF—β1雙基

6、因轉(zhuǎn)染的軟骨細胞生物學活性優(yōu)于兩者中的任一單基因轉(zhuǎn)染，為基因治療骨關節(jié)炎的研究提供實驗基礎。 第二部分聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染治療兔膝骨關節(jié)炎的研究 目的:觀察白細胞介素-1受體拮抗蛋白(IL-1Ra)與轉(zhuǎn)化生長因子—β1(TGF—β1)雙基因轉(zhuǎn)染在關節(jié)中的表達及對骨關節(jié)炎的治療效果。 方法:以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，體外轉(zhuǎn)染同種異體原代軟骨細胞，將轉(zhuǎn)染了外源基因的軟骨細胞注射入兔膝關節(jié)腔。前交叉韌帶切斷法(ACLT)制成新西蘭白

7、兔膝關節(jié)OA模型，共30只，隨機分為5組，Ⅰ組為空白對照組，Ⅱ組為手術對照組，Ⅲ組為IL-1Ra轉(zhuǎn)染組，Ⅳ組為TGF—β1轉(zhuǎn)染組，Ⅴ組為IL-1Ra和TGF—β1雙基因轉(zhuǎn)染組。外源基因注射后第4周與第8周，用PBS灌洗兔膝關節(jié)，ELISA分析轉(zhuǎn)基因表達，硝酸還原法檢測膝關節(jié)液中NO含量，取關節(jié)標本進行Mankin’s評分，阿爾辛藍—過碘酸雪夫試劑(AB—PAS)染色，TGF—β1、IL-1Ra及Ⅱ型膠原免疫組化、原位雜交檢測。

8、結果：ELISA檢測顯示在第4周基因轉(zhuǎn)染組有明顯的基因表達，第8周基因表達減弱；手術對照組軟骨損傷程度最大，Mankin’s評分明顯高于其他組；TGF—β1、IL-1Ra及Ⅱ型膠原免疫組化染色，手術對照組灰度值低于其他組，單基因轉(zhuǎn)染組灰度值低于雙基因轉(zhuǎn)染組，8周時各對應組灰度值較4周有明顯下降。 結論:以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體將轉(zhuǎn)染了外源基因的軟骨細胞轉(zhuǎn)入骨關節(jié)炎關節(jié)內(nèi)，可獲得穩(wěn)定的外源基因表達，TGF—β1和IL-1Ra可有效阻止O