聯(lián)合基因治療骨關(guān)節(jié)炎-IL-1Ra聯(lián)合自殺基因HSV-tk體外轉(zhuǎn)染滑膜細(xì)胞促使炎性介質(zhì)釋放減少并抑制過度增生的滑膜細(xì)胞.pdf

1、目的:骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種常見的,影響大眾尤其是中老年人群正?；顒拥闹饕P(guān)節(jié)疾病,給個人和社會帶來了巨大的身心和經(jīng)濟上的負(fù)擔(dān)。本病的發(fā)病趨勢沒有明顯的種族和地域性,發(fā)病機制涉及形態(tài)學(xué),生化,代謝等多方面的改變。在骨關(guān)節(jié)炎的病理改變中,大量炎性介質(zhì)的釋放是造成局部關(guān)節(jié)改變的重要因素。這些促炎性因子中,IL-1,TNF無疑扮演了重要的角色。針對這些細(xì)胞因子的生物學(xué)功能研制開發(fā)了一系列的治療手段。隨著該領(lǐng)域研究的進(jìn)展,骨關(guān)節(jié)炎的病理改變中滑

2、膜組織所起到的作用也得到了越來越多的重視?；そM織釋放的炎性介質(zhì)造成關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨基質(zhì)的降解,加重關(guān)節(jié)局部炎性改變。而其本身的過度增生也是導(dǎo)致關(guān)節(jié)本身退化、局部腫脹的重要因素之一,并引發(fā)了包括疼痛以及局部功能障礙等一系列臨床表現(xiàn)。本實驗中,我們使用基因治療的方法,利用重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV),將外源性抑炎性因子基因聯(lián)合自殺基因?qū)塍w外培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞,試圖減少滑膜細(xì)胞促炎性因子的釋放并抑制過度增生的滑膜細(xì)胞,以此來達(dá)到治療骨關(guān)節(jié)炎的目的

3、。
　　 方法:利用rAAV,將抗炎因子白介素-1受體拮抗劑(IL-1Ra)聯(lián)合單純皰疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)自殺基因系統(tǒng)引入體外培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞,觀察其在抑制促炎性因子分泌以及誘導(dǎo)靶細(xì)胞死亡以控制滑膜細(xì)胞增生的效果。所有實驗分組除非特殊說明否則均為:A組導(dǎo)入IL-1Ra基因,B組導(dǎo)入HSV-tk基因,C組導(dǎo)入IL-1Ra聯(lián)合HSV-tk基因,D組為對照組,轉(zhuǎn)染含空質(zhì)粒的rAAV。首先,利用攜帶報告基因EGFP的病毒載體轉(zhuǎn)

4、染滑膜細(xì)胞以此來觀測該病毒載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)細(xì)胞的情況并確定最佳的轉(zhuǎn)染條件。涉及更昔洛韋(GCV)的細(xì)胞毒作用,分別設(shè)置HSV-tk(-)組和HSV-tk(+)組等兩組獨立實驗;GCV的濃度分5組為0.1、1、10、100、1000(單位:μg/ml);設(shè)置時間段為24小時至96小時,4個時間段進(jìn)行檢測,時間間隔為24小時,利用MTT檢測細(xì)胞生長抑制情況。自殺基因的旁觀者效應(yīng)同樣采用MTT。目的基因,包括:IL-1Ra、IL-1β、TNF

5、-α、HSV-tk,其表達(dá)量使用了real-time PCR進(jìn)行分析,并用相對定量的方法—2-ΔΔCT進(jìn)行表達(dá)量的分析。涉及相關(guān)因子包括:IL-1Ra、IL-1β、INF-α的含量水平的表達(dá)則利用ELISA進(jìn)行檢測。最后,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測由自殺基因誘導(dǎo)的靶細(xì)胞凋亡情況。采用Annexin V-FITC-PI雙染法進(jìn)行滑膜細(xì)胞凋亡的測定。
　　 結(jié)果:首先,就自殺基因HSV-tk以及其產(chǎn)生的旁觀者效應(yīng)來看,結(jié)果發(fā)現(xiàn):HSV-tk

6、(-)組細(xì)胞生長抑制情況基本呈濃度依賴的正相關(guān),但不同GCV濃度以及不同時間段對比缺乏統(tǒng)計學(xué)差異;反觀HSV-tk(+)組,除去表現(xiàn)出的GCV濃度依賴關(guān)系外,不同時間段以及不同藥物劑量分組間有統(tǒng)計學(xué)差異。根據(jù)該實驗結(jié)果,選取了GCV濃度為100μg/ml,給藥后72小時為后續(xù)實驗的基礎(chǔ)條件。旁觀者效應(yīng)的MTT分析中發(fā)現(xiàn):HSV-tk(+)細(xì)胞所占比例為50％時細(xì)胞生長抑制率為77.31±5.44％。通過分析認(rèn)為該自殺基因陽性細(xì)胞比例使實

7、驗結(jié)果最優(yōu)化。結(jié)果以平均值±S.D表示,n=3,P＜0.05。在real-time PCR對目的基因表達(dá)量的檢測中,IL-1Ra,基因的表達(dá)量在A組和C組分別為66.49±10.85,117.63±21.88,而未導(dǎo)入IL-1Ra基因的B組為24.42±5.83。IL-1β的表達(dá)量在A、B、C三組分別下降至0.028±0.017,0.102±0.034和0.017±0.005。同樣,自殺基因HSV-tk在被導(dǎo)入了該基因的B、C兩組表達(dá)顯

8、著,分別是252.663±53.673和513.867±120.821。而未導(dǎo)入該基因的A組表達(dá)量為6.720±2.429.然而,這種統(tǒng)計學(xué)的改變在TNF-α的基因表達(dá)上并不明顯,三組實驗組A、B、C的表達(dá)量分別是3.563±2.511,5.523±2.285,1.017±0.162。結(jié)果以平均值+SEM來表示,n=3,P＜0.05。相似的趨勢在蛋白水平的測定上也可發(fā)現(xiàn),通過EIASA的檢測,IL-1Ra的水平在A組達(dá)到56.723±6

9、.563 pg/ml,B組為30.790±8.431 pg/ml C組76.277±10.380pg/ml,而對照組D組為11.467±3.657pg/ml。相應(yīng)的,IL-1β在A組的水平下降到14.343±4.232 pg/ml,B組為21.300±5.112 pg/ml,C組為6.534±2.353 pg/ml,相比較D組則是52.287±9.636 pg/ml。同樣,TNF-α通過ELISA檢測也缺乏相應(yīng)的變化。其水平在三個實驗組

10、A、B、C分別為9.733±5.804 pg/ml,14.247±2.255 pg/ml,6.527±3.785pg/ml,而在對照組D則為4.637±2.799 pg/ml。統(tǒng)計結(jié)果以平均值±SEM表示,n=3。對于自殺基因誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的過程,72小時給予GCV后,倒置顯微鏡下可觀察到大批貼壁細(xì)胞漂浮在培養(yǎng)液中,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測,在導(dǎo)入HSV-tk的B、C兩組,細(xì)胞的凋亡率分別為65.70％和69.40％,而在未導(dǎo)入HSV-tk的A