慢病毒介導人CCL21基因轉染對胰腺癌細胞(PANC-1)作用的實驗研究.pdf

1、胰腺癌(pancreas cancer)是惡性程度較高的腫瘤之一,其發(fā)病率呈上升趨勢。大多數胰腺癌患者出現癥狀就診時已屬中晚期,即使手術治療,預后亦較差,且其具有周圍血管浸潤和嗜神經生長特性,早期診斷率較低,易于轉移,其分化程度和淋巴轉移直接影響患者的預后,因此,對于深入研究胰腺癌的治療意義重大。
　　 趨化因子(chemokine)是一類結構同源、功能相似的細胞因子超家族,其作用是啟動并調節(jié)特異性細胞在體內遷移與定位,其中部分

2、細胞正是機體抗腫瘤免疫的效應細胞。次級淋巴組織趨化因子(secondary lymphoid tissue chemokine,SLC)屬于CC亞族趨化因子,即CCL21,通過趨化、介導免疫細胞產生抗腫瘤免疫應答,發(fā)揮抗腫瘤免疫效應,但其又具有雙向效應,可促進腫瘤細胞分泌蛋白水解酶,加快腫瘤細胞的侵襲轉移,導致腫瘤進展。
　　 慢病毒(Lentivirus)載體是一類重組反轉錄病毒載體,由慢病毒經過改造而成,具有更高的生物安全性

3、和外源基因的表達效率,它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力,并可以在體內較穩(wěn)定的表達,其感染目的細胞后不會再感染其他細胞,也不會利用宿主細胞產生新的病毒顆粒,安全性好。慢病毒載體是目前基因治療中研究較多的載體。
　　 目的:
　　 本課題研究通過克隆人的CCL21基因,構建pEASY-T1 simple-CCL21質粒,經序列測定后進一步構建人CCL21基因慢病毒表達載體,穩(wěn)定轉染Real-time PCR篩選出的高表

4、達CCR7的胰腺癌細胞株PANC-1,觀察細胞生物學行為的變化,進一步通過PCR基因芯片檢測目的基因轉染后細胞內信號通路中某些基因的變化,探討人CCL21基因轉染對胰腺癌的作用。
　　 方法:
　　 1.利用基因克隆技術克隆出人CCL21基因,連接在pEASY-T1 simple cloningvector上,構建成pEASY-T1 simple-CCL21質粒,再進行序列測定;
　　 2.利用基因重組技術將人C

5、CL21基因連接慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EFI-copGFP,進行病毒包裝,滴度測定后濃縮純化;
　　 3.利用Real-time PCR從培養(yǎng)的5種人胰腺癌細胞株(AsPC-1,BxPC-3,CFPAC-1,PANC-1,SW1990)中篩選出高表達CCR7的細胞株;
　　 4.通過慢病毒轉染預實驗確定MOI,進行人CCL21重組慢病毒載體轉染PANC-1細胞株,分為陽性實驗組、陰性對照組、空白對照組,利用

6、PCR、Western blot技術進行驗證,觀察轉染后PANC-1細胞株生物學行為的變化。
　　 5.采用RT2profilerTMPCR芯片檢測與腫瘤侵襲轉移、血管生成、凋亡、黏附、細胞周期、信號轉導等有關因子的84個基因,深入分析基因變化趨勢,Westem blot驗證,探討人CCL21基因對PANC-1細胞株侵襲轉移的作用。
　　 實驗結果均采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗和單因素方差分析,以P＜0.05為

7、差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1.克隆出人CCL21基因,成功構建pEASY-T1 simple-CCL21質粒,測序結果顯示與人類基因庫中CCL21基因序列完全一致;
　　 2.成功構建慢病毒載體質粒pCDH-CMV-MCS-EFI-copGFP-CCL21,經病毒包裝后得到攜帶hCCL21的成熟的重組慢病毒顆粒Lenti-hCCL21,濃縮后病毒滴度達到1.25×108TU/ml;
　　 3

8、.從5種人胰腺癌細胞株(AsPC-1,BxPC-3,CFPAC-1,PANC-1,SW1990)中篩選出高表達CCR7的細胞株PANC-1;
　　 4.重組慢病毒顆粒Lenti-hCCL21成功轉染胰腺癌細胞株PANC-1,并穩(wěn)定表達,但PANC-1細胞生物學行為無明顯變化;
　　 5.通過RT2ProfilerTMPCR芯片篩選出8個明顯變化基因,其中上調基因2個,分別為:ATM,BRCA1;下調基因6個,分別為:AK

9、T1,CASP8,FOS,IL8,ITGA2,JUN;根據基因功能不同分類,其中與凋亡有關基因為CASP8;與信號轉導與轉錄有關基因為AKT1,FOS,FUN;與細胞周期有關基因為ATM,BRCA1;與血管生成有關基因為IL8;與粘附作用有關基因為ITGA2;此外,MMP-9基因變化低于2倍,陽性實驗組比空白對照組、陰性對照組分別上調1.40倍,1-31倍,而TIMP1基因陽性實驗組比空白對照組、陰性對照組分別下調1.01倍,1.02倍

10、,Western blot檢測結果顯示陽性實驗組MMP-9的表達量比陰性對照、空白對照組增加。
　　 結論:
　　 本課題研究,利用基因克隆技術成功克隆出人CCL21基因,采用基因重組技術成功構建CCL21重組慢病毒載體,包裝成熟的重組慢病毒顆粒Lenti-hCCL21穩(wěn)定轉染高表達CCR7的胰腺癌細胞株PANC-1,但轉染后的PANC-1細胞其生物學行為未發(fā)生明顯變化,進一步通過RT2profilerTMPCR芯片篩選