腺相關(guān)病毒介導的OP-1和hVEGF基因轉(zhuǎn)染阻逆羊退變椎間盤的生物學效應.pdf

1、目的：
　　通過纖維環(huán)16G針頭穿刺的方法建立一種羊椎間盤緩慢退行性變動物模型;觀察腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)載體能否在山羊退變椎間盤體內(nèi)安全有效的表達;觀察腺相關(guān)病毒介導的成骨蛋白-1(osteogenic protein，OP-1)基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染羊退行性變椎間盤的細胞后有效持續(xù)表達對退變椎間盤的修復效果;觀察腺相關(guān)病毒介導的人血管內(nèi)皮生長因子基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染能否有效持續(xù)表達并促進退變椎間盤修復

2、;觀察腺相關(guān)病毒介導的OP-1基因聯(lián)合hVEGF基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染羊退行性變椎間盤的細胞后能否有效的持續(xù)表達，并對退變椎間盤的產(chǎn)生更佳的修復效果。
　　方法：
　　1.動物分組:88只清潔級山羊(specific pathogen free，SPF)，抽取4只作為備用動物為H組;A組，8只動物為AAV-OP-1注射組;B組，8只動物為AAV-VEGF注射組;C組，8只動物為AAV-OP-1聯(lián)合AAV-VEGF注射組;D組，8動物為

3、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）注射組（安慰劑，對照組）;E組，4只動物為AAV-EGFP注射;F組，8動物為單純針刺造模組;G組為剩余的8只動物，也做手術(shù)，但不損傷椎間盤。即G組和H組的動物椎間盤是完整的。
　　2.制作纖維環(huán)針刺動物模型。排除G組和H組，將剩余的76只動物來做退變動物模型。在全麻下，采取側(cè)俯臥位，經(jīng)腹膜外入路顯露椎間盤，任意選相連的3個椎間盤，用16G針頭穿刺纖維環(huán)，穿刺

4、點位于纖維環(huán)中央偏左側(cè)平行于下位椎體的上終板并控制其深度為10mm、旋轉(zhuǎn)180度。用黑色縫在相應椎間盤的橫突作標記。
　　3.動物體內(nèi)椎間盤基因轉(zhuǎn)染（A、B、C、D、E組）。時間為造模后第4周（28天）。采用相同的手術(shù)入路。A組動物造模間盤用27G針頭的顯微注射器各注射50ulAAV-OP-1(1×1012vg/L);B組動物造模間盤注射50ul AAV2-VEGF(1×1012vg/L);C組造模問盤各注射50ul AAV-OP

5、-1和AAV-VEGF(1×1012vg/L);D組造模間盤各注射50ul PBS;E組造模間盤各注射50 ulAAV-EGFP(1×1012vg/L)。造模后6周(42d)、8周(56d)、12周(84d)、16周(102d)，OP-1、VEGF、雙基因聯(lián)合、空白對照組每組分別殺死4只動物，F(xiàn)、G組每組分別殺死2只動物，取得造模間盤;造模后16周處死E組4只羊，收獲椎間盤組織。
　　4.影像學觀察，分別于0周、4周(28d)、6

6、周(42d)、8周(56d)、12周(84d)、16周(102d)拍攝腰椎正側(cè)位DR平片，應用PACS系統(tǒng)做數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。
　　5.組織學觀察，采用HE染色、Safranine O染色、Masson染色、免疫組化等方法，定性、定量觀察椎間盤退行性變的發(fā)展變化。
　　6.生物化學檢測，采用免疫熒光、免疫印跡Western-Blot法檢測等定性、定量觀察基因表達的生物學效應。
　　7.統(tǒng)計數(shù)據(jù)。采用SPSS17.0進行統(tǒng)

7、計學分析，單因素方差分析，數(shù)據(jù)以±SD表示，p＜0.01認為差異有顯著統(tǒng)計學意義，p＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果
　　1.影像學分析結(jié)果:OP-1組動物的造模椎間盤高度大于空白對照組，其％DHI與空白對照組有明顯差異(P＜0.05)，雙基因聯(lián)合組的造模椎間盤高度恢復的最佳，其％DHI與空白對照組有顯著差異(P＜0.05)，VEGF組和F組動物的造模椎間盤高度均持續(xù)下降，與空白對照組數(shù)據(jù)相似，其％ DHI與空白對

8、照組數(shù)據(jù)分析，均無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2.Ⅱ型膠原免疫組化染色:OP-1組動物的造模椎間盤髓核內(nèi)的Ⅱ型膠原含量在造模6周、8周、12周、16周時高均于空白對照組、F組，在16周時差異最顯著，其Ⅱ型膠原免疫組化染色的平均光密度值與空白對照組有明顯差異(P＜0.05)，OP-1能在動物體內(nèi)促進Ⅱ型膠原合成代謝。VEGF組與D、F組動物造模椎間盤髓核Ⅱ型膠原含量在各個時期無顯著性差異，VEGF組和F組動物的造模椎間盤Ⅱ

9、型膠原均持續(xù)下降，與空白對照組數(shù)據(jù)相似，其Ⅱ型膠原免疫組化染色的平均光密度值與空白對照組數(shù)據(jù)分析，均無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。雙基因聯(lián)合組動物的造模椎間盤髓核內(nèi)的Ⅱ型膠原含量在造模6周、8周、12周、16周時高均于空白對照組、F組，在12和16周時差異最顯著，其Ⅱ型膠原免疫組化染色的平均光密度值與空白對照組有顯著差異(P＜0.01)，OP-1與VEGF雙基因能顯著提高動物體內(nèi)Ⅱ型膠原的合成代謝。
　　3.Ⅰ型膠原免疫組化染

10、色:OP-1組動物的造模椎間盤髓核內(nèi)的Ⅰ型膠原含量在造模6周、8周、12周、16周時高均于空白對照組、F組，在16周時差異最顯著，其Ⅰ型膠原免疫組化染色的平均光密度值與空白對照組有明顯差異(P＜0.05)，OP-1能在動物體內(nèi)促進Ⅰ型膠原合成代謝。VEGF組與D、F組動物造模椎間盤髓核Ⅰ型膠原含量在各個時期無顯著性差異，VEGF組和F組動物的造模椎間盤Ⅰ型膠原均持續(xù)下降，與空白對照組數(shù)據(jù)相似，其Ⅰ型膠原免疫組化染色的平均光密度值與空白對

11、照組數(shù)據(jù)分析，均無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。雙基因聯(lián)合組動物的造模椎間盤髓核內(nèi)的Ⅰ型膠原含量在造模6周、8周、12周、16周時高均于空白對照組、F組，在16周時差異最顯著，其Ⅰ型膠原免疫組化染色的平均光密度值與空白對照組有顯著差異(P＜0.01)，OP-1與VEGF雙基因能顯著提高動物體內(nèi)Ⅰ型膠原的合成代謝。
　　4.35S測定蛋白多糖合成率:OP-1組動物的造模椎間盤髓核內(nèi)的蛋白多糖含量在造模6周、8周、12周、16周時高

12、均于空白對照組、F組，在16周時差異最顯著，其35S蛋白多糖合成率與空白對照組有明顯差異(P＜0.05)，OP-1能在動物體內(nèi)促進蛋白多糖的合成代謝。VEGF組與D、F組動物髓核蛋白多糖含量在各個時期無顯著性差異，VEGF組和F組動物的造模椎間盤蛋白多糖含量均持續(xù)下降，與空白對照組數(shù)據(jù)相似，其35S蛋白多糖合成率與空白對照組數(shù)據(jù)分析，均無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。雙基因聯(lián)合組動物的造模椎間盤髓核內(nèi)的蛋白多糖含量在造模6周、8周、1

13、2周、16周時高均于空白對照組、F組，在12和16周時差異最顯著，其35S蛋白多糖合成率與空白對照組有顯著差異(P＜0.01)，OP-1與VEGF雙基因能顯著提高動物體內(nèi)蛋白多糖的合成代謝。
　　5.Western Blot法檢測Ⅱ型膠原:OP-1組動物的造模椎間盤髓核內(nèi)的Ⅱ型膠原含量在造模6周、8周、12周、16周時高均于空白對照組、F組，在16周時差異最顯著，其Ⅱ型膠原蛋白灰度值與空白對照組有明顯差異(P＜0.05)，OP-1

14、能在動物體內(nèi)促進Ⅱ型膠原合成代謝。VEGF組與D、F組動物造模椎間盤髓核Ⅱ型膠原含量在各個時期無顯著性差異，VEGF組和F組動物的造模椎間盤Ⅱ型膠原均持續(xù)下降，與空白對照組數(shù)據(jù)相似，其Ⅱ型膠原蛋白灰度值與空白對照組數(shù)據(jù)分析，均無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。雙基因聯(lián)合組動物的造模椎間盤髓核內(nèi)的Ⅱ型膠原含量在造模6周、8周、12周、16周時高均于空白對照組、F組，在12和16周時差異最顯著，其Ⅱ型膠原蛋白灰度值與空白對照組有顯著差異(P