腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的PD-L1基因轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠移植肝的保護(hù)作用及其機(jī)制.pdf

1、研究背景： 器官移植后器官功能維持的主要障礙是術(shù)后排斥反應(yīng)和免疫抑制劑的毒性。基因治療為肝移植領(lǐng)域供肝抵抗移植后排斥反應(yīng)和損傷提供了新的治療思路。將免疫調(diào)節(jié)基因?qū)胍浦哺蝺?nèi)，使其表達(dá)致耐受分子，產(chǎn)生能抑制受體免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子，可有效地抑制排斥反應(yīng)的發(fā)生和增強(qiáng)移植肝的保護(hù)功能，能在不用或少量使用免疫抑制劑的情況下延長(zhǎng)移植肝存活，甚至長(zhǎng)期存活。 程序性死亡配體-1(Programmed Death Ligand-1，PD-

2、L1)是一種重要的抑制性共刺激分子，可通過(guò)激活初始T細(xì)胞、抑制活化的效應(yīng)T細(xì)胞及調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌等參與多種免疫過(guò)程。體外研究發(fā)現(xiàn)：PD-L1與其受體程序性死亡-1(Programmed Death-1，PD-1)結(jié)合后，能抑制活化T細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的產(chǎn)生。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，在心臟、胰島、角膜、皮膚等多種器官移植模型中，PD-L1均能抑制排斥反應(yīng)及延長(zhǎng)移植物的存活；這強(qiáng)烈提示了PD-L1可能具有保護(hù)移植肝免受排斥反應(yīng)損傷的治療潛能。PD

3、-L1可通過(guò)多種機(jī)制產(chǎn)生免疫抑制效應(yīng)，與肝移植聯(lián)系起來(lái)考慮，它可能通過(guò)抑制活化T細(xì)胞的增殖及細(xì)胞因子的合成、分泌，從而阻斷宿主對(duì)移植肝的攻擊。此外，免疫抑制分子的局部表達(dá)有可能減少其全身性副作用、增加其生物利用度及治療效應(yīng)，因此是減輕排斥反應(yīng)、促進(jìn)移植物長(zhǎng)期存活的很有前景的方法。腺相關(guān)病毒(Adeno-associated Virus，AAv)是移植物保護(hù)分子轉(zhuǎn)染和表達(dá)的理想載體。報(bào)告基因紅色熒光蛋白(Red Fluorescent P

4、rotein，RFP)因其具有靈敏度高、信號(hào)清楚等特點(diǎn)亦日益受到關(guān)注。 研究目的： 基于以上分析，本研究擬通過(guò)建立近交系大鼠原位肝移植模型，以RFP為報(bào)告基因，將AAV作為PD-L1的載體，采用冷保存期門靜脈灌注夾閉法轉(zhuǎn)染供肝，觀察其安全性和有效性。在此基礎(chǔ)上，于活體內(nèi)觀察PD-L1基因轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠異基因肝移植術(shù)后肝臟的保護(hù)作用及其與亞劑量CsA的協(xié)同效果，并通過(guò)檢測(cè)PD-L1對(duì)移植肝CD4+、CD8+、CD25+淋巴細(xì)胞

5、浸潤(rùn)及細(xì)胞因子INF-γ、IL-17、IL-10、TGF-β1表達(dá)的影響，試圖闡明PD-L1在抑制大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)中的可能機(jī)制。 方法與結(jié)果： 第一部分近交系大鼠肝移植急性排斥模型的建立及排斥反應(yīng)觀察 大鼠隨機(jī)分為3組：①G1(同基因肝移植組)；②G2(異基因肝移植組)；③G3(CsA組，移植后0～7d腹腔注射CsA2.5mg/Kg.d，余同G2)。采用改良“二袖套法”建立大鼠肝移植急性排斥模型。術(shù)后觀察一

6、般情況、平均存活時(shí)間(Median Survival Time，MST)，分別在術(shù)后3、7、14及21d采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能，光鏡下觀察移植肝組織學(xué)變化，根據(jù)Banff標(biāo)準(zhǔn)判斷排斥反應(yīng)強(qiáng)度。結(jié)果表明：在無(wú)外界干預(yù)的情況下，G1大鼠無(wú)急性排斥表現(xiàn)；G2受體多在術(shù)后7d出現(xiàn)耳廓黃染、尿黃等，至14d進(jìn)行性加重伴血性腹水等；G3用藥期間大鼠精神差，停藥后逐漸恢復(fù)，至14d出現(xiàn)輕度急排表現(xiàn)；三組大鼠MST分別為：G1(106.7±0.

7、24)d，G2(18.3±1.15)d和G3(28.7±0.98)d，G3較G2明顯延長(zhǎng)，差異顯著(P<0.05)；肝功及肝組織病理學(xué)改變?cè)缬谏鲜霰憩F(xiàn)，術(shù)后3d急排大鼠ALT、TBIL明顯升高伴輕度的排斥反應(yīng)病理改變，7d后上述指標(biāo)進(jìn)一步惡化，至14d最為典型，與G1、G3相比差異顯著(P<0.05)；各時(shí)段排斥分級(jí)與病理變化趨勢(shì)一致：術(shù)后3d G3與G2急性排斥活動(dòng)指數(shù)(ReiectionActivity Index，RAI)評(píng)分無(wú)明

8、顯差異，而7d、14d及21d G2 RAI評(píng)分明顯高于G1、G3(P<0.05)。 第二部分重組PD-L1-AAV2-RFP轉(zhuǎn)染大鼠移植肝的安全性和有效性 1.重組PD-L1-AAV2-RFP載體PCR鑒定：以重組載體為模板，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，取PCR產(chǎn)物行1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增條帶與預(yù)期的891bp大小的特異性條帶相吻合，表明PD-L1基因構(gòu)建正確。 2.重組PD-L1-AAV2-R

9、FP載體感染活性檢測(cè)：重組病毒感染BHK細(xì)胞后熒光顯微鏡下觀察RFP基因表達(dá)。結(jié)果表明PD-L1-AAV2一RFP感染后24h即可觀察到紅色熒光，48h后轉(zhuǎn)染率可達(dá)30％，表明其具有較強(qiáng)的感染活性，可用于體內(nèi)外轉(zhuǎn)染研究。 3.大鼠隨機(jī)分為3組：①G1(同基因肝移植組)；②G2(AAV空載體組，供肝切取后經(jīng)門靜脈灌注AAV2-RFP空病毒液夾閉冷轉(zhuǎn)染供肝2h，移植前乳酸林格氏液經(jīng)門靜脈沖洗供肝，余同G1)；③G3(PD-L1轉(zhuǎn)染組

10、，所用灌注液為PD-L1-AAV2-RFP，余同G2)。改良“二袖套法”建立大鼠肝移植基因轉(zhuǎn)染模型，于熒光顯微鏡下觀察移植肝RFP的表達(dá)，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR、IHC從mRNA及蛋白水平檢測(cè)移植肝PD-L1的表達(dá)，肝功能及肝組織病理檢測(cè)同第一部分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ALT與TBIL分別于術(shù)后3d、7d達(dá)到峰值，14d基本恢復(fù)正常，各組間無(wú)顯著性差異；與未轉(zhuǎn)染組相比，PD-L1轉(zhuǎn)染后肝組織病理未見明顯差異；G2、G3術(shù)后7d即可在熒光

11、顯微鏡下觀察到微弱的紅色熒光，14、21d逐漸增強(qiáng)，呈高亮度的紅色熒光，而三組大鼠肝外器官中始終無(wú)紅色熒光；RT-PCR及IHC檢測(cè)顯示未轉(zhuǎn)染組PD-L1mRNA基因和蛋白均微弱表達(dá)；PD-L1轉(zhuǎn)染7d后隨時(shí)間延長(zhǎng)靶基因表達(dá)逐漸增強(qiáng)，21d達(dá)峰值，主要位于匯管區(qū)周圍；除3d外，余各時(shí)段PD-L1基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)G3較G1、G2明顯增強(qiáng)(P<0.05)。 第三部分腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的PD-L1表達(dá)對(duì)大鼠移植肝的保護(hù)作用及其機(jī)制

12、 大鼠隨機(jī)分為6組：①G1(同基因肝移植組)；②G2(異基因肝移植組)；③G3(AAV空載體組，供肝切取后經(jīng)門靜脈灌注AAV2-RFP空病毒液夾閉冷轉(zhuǎn)染供肝2h，移植前乳酸林格氏液經(jīng)門靜脈沖沈供肝，余同G2)；④G4(CsA組，移植后0～7d予腹腔注射CsA2.5mg/kg.d，余同G2)；⑤G5(PD-L1轉(zhuǎn)染組，所用灌注液為PD-L1-AAV2-RFP，余同G3)；⑥G6(聯(lián)合治療組，所用灌注液為PD-L1-AAV2-RFP，術(shù)后

13、0～7d予腹腔注射CsA2.5mg/kg.d，余同G2)。改良“二袖套法”建立大鼠肝移植模型，利用組織病理、IHC、ELISA等技術(shù)，觀察術(shù)后移植肝病理改變、PD-L1蛋白表達(dá)及其對(duì)移植肝CD4+、CD8+、CD25+細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞因子INF-γ、IL-17、IL-10、TGF-β1表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：G1大鼠無(wú)急性排斥表現(xiàn)；肝功能損害較輕，ALT與TBIL分別于術(shù)后3d、7d達(dá)到峰值，14d基本恢復(fù)正常：肝臟病理學(xué)呈Banff0級(jí)排

14、斥反應(yīng)；各時(shí)段PD-L1蛋白微弱表達(dá)；匯管區(qū)未見明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；IFN-γ無(wú)明顯表達(dá)，而IL-17、IL-10和TGF-β1呈低表達(dá)；大鼠MST為(106.7±0.24)d。G2、G37d開始出現(xiàn)急排表現(xiàn)，14d癥狀加重；肝功能指標(biāo)明顯惡化；肝臟病理學(xué)呈Banff II～I(xiàn)II級(jí)排斥反應(yīng)，RAI評(píng)分隨時(shí)間推移逐漸升高；各時(shí)段PD-L1蛋白微弱表達(dá)；移植肝大量CD4+、CD8+、CD25+細(xì)胞浸潤(rùn)；細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17上調(diào)表達(dá)

15、，而IL-10、TGF-β1表達(dá)下降；大鼠MST為(18.3±1.15)d、(18.3±0.72)d。與G2、G3相比，G4、G5及G6大鼠發(fā)生急性排斥反應(yīng)的時(shí)間均明顯延遲，直至14d才出現(xiàn)輕度排斥表現(xiàn)；肝功能部分改善，術(shù)后出現(xiàn)ALT、TBIL再次升高及肝功能衰竭的時(shí)間明顯推遲；肝臟病理學(xué)呈Banff I～I(xiàn)I級(jí)排斥反應(yīng)；G5、G6各時(shí)段移植肝PD-L1蛋白的表達(dá)隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)，G4無(wú)明顯變化；移植肝CD4+、CD8+、CD25+細(xì)胞浸

16、潤(rùn)明顯減少，尤以CD8+細(xì)胞為著(P<0.05)；移植肝細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17含量顯著下降，而IL-10、TGF-β1含量明顯升高，差異顯著(P<0.05)；受體MST明顯延長(zhǎng)，但未獲得長(zhǎng)期存活，僅為(28.7±0.98)d、(29.3±1.47)d。PD-L1基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合亞劑量CsA治療的大鼠各時(shí)段肝功能損害進(jìn)一步減輕，RAI評(píng)分顯著降低，受體MST明顯延長(zhǎng)至(34.0±1.49)d(P<0.05)。 四、結(jié)論：

17、 1.采用改良“二袖套法”成功建立了LEW-BN組合大鼠肝移植急性排斥模型。 2.冷保存期經(jīng)門靜脈灌注PD-L1-AAV2-RFP夾閉法轉(zhuǎn)染供肝，可安全、有效地將目的基因轉(zhuǎn)染至大鼠移植肝內(nèi)并分泌功能性蛋白。 3.在本實(shí)驗(yàn)條件下，采用PD-L1-AAV2-RFP(1×1011v.g./只)經(jīng)門靜脈灌注夾閉冷保存2h是介導(dǎo)足量蛋白表達(dá)的理想方案。 4.腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的PD-L1基因轉(zhuǎn)染對(duì)移植肝具有顯著的保護(hù)作用，可