ad.cmvhsp70腺病毒載體的構(gòu)建及其對大鼠移植肝的保護(hù)作用

1、蘇州大學(xué)博士學(xué)位論文Ad.CMV-HSP70腺病毒載體的構(gòu)建及其對大鼠移植肝的保護(hù)作用姓名：秦磊申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：普通外科指導(dǎo)教師：錢海鑫20040401坐坐塑￡豎堅(jiān)生堡墮童冀壁墮塑堡星苧墮盔墮整墊壁墮堡塑堡旦 ±皇堡鐾第三部分：目的：構(gòu)建重組腺病毒載體A d ．C M V - H S P 7 0 ，將人熱休克蛋白7 0 基闋置丁m c M v 啟動于控制之F 。方法：j 千j 酶切法將人熱休克蛋白7 0 1 ≯3 全長

2、．c D N A 插入腺病毒穿梭質(zhì)粒載體P D C 3 1 2 - C M V 的彰克隆位點(diǎn)。鑒定、篩選包含目的基因的正確克隆，將其與腺病毒骨架質(zhì)粒載體p B G H △E 3 一起用l i p o f e c t a m i n e 共轉(zhuǎn)染至2 9 3 細(xì)胞中，使其在2 9 3 細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組及包裝。用酶切法十和I P C R法鑒定后，在2 9 3 細(xì)胞中大量擴(kuò)增，密度梯度離心純化。結(jié)果：產(chǎn)物經(jīng)鑒定后為包含有H S P 7

3、0 全長序列的腺病毒載體，H S P 7 0 基因位于其m C M V 啟動子控制之下。經(jīng)擴(kuò)增純化后濃度為3 ．0 ×1 0 ?p f u ／m t ，共2 m l 。結(jié)論：C r e 酶介導(dǎo)的l o x P 位點(diǎn)特異性重組是一種簡單、高效的腺病毒載體構(gòu)建方法，具有構(gòu)建速度快、成功率高、準(zhǔn)確率高等特點(diǎn)。第四部分：目的：觀測我們構(gòu)建的A d ．C M V - H S P 7 0 腺病毒載體在大鼠體內(nèi)的表達(dá)及其對大鼠原位肝臟移植中

4、移植肝的保護(hù)作用。方法：術(shù)前2 4 d “ 時將A d ．C M V - H S P 7 0 通過門靜脈注入實(shí)驗(yàn)組供體大鼠肝臟，3 ．0 ×1 0 9 ／只。供肝獲取后將其保存在4 0 C 的乳酸鈉林格氏液中4 小時，二袖套法行原位肝臟移植術(shù)。門靜脈復(fù)流后觀測兩組受體膽汁分泌情況，術(shù)后3 小時處死受體大鼠，檢測血漿中A S T 、A L T 、L D H 水平，切取肝臟組織，W e s t e r nb l o t t i n

5、 g 檢測H S P 7 0 的表達(dá)，免疫組化法檢測H S P 7 0 、T N F ．a(chǎn) 的表達(dá)，T U N E L法檢測肝臟組織中細(xì)胞的凋亡水平。結(jié)果：W e s t e m b l o t t i n g 顯示實(shí)驗(yàn)組肝臟組織高表達(dá)H S P 7 0 ，而對照組僅痕量表達(dá)。術(shù)厲3 4 , 時，實(shí)驗(yàn)組膽汁分泌量多于對照組，而A S T 、A L l ’、L D H 水平明顯低于對照組。免疫組化顯示實(shí)驗(yàn)組肝臟中H S P 7 0 表達(dá)明

6、顯，而對照組則為陰性。對照組T N F ．a(chǎn) 免疫組化染色為陽性，實(shí)驗(yàn)組為陰性。實(shí)驗(yàn)組凋亡水平明顯低于對照組。結(jié)論：我們構(gòu)建的A d ．C M V - H S P 7 0 可以在大鼠體內(nèi)有效表達(dá)。經(jīng)門靜脈注射的方法( 3 x l O 々只) 可以有效的將目的基因轉(zhuǎn)染入大鼠肝臟。高表達(dá)H s p 7 0 的移植肝對缺血再灌注損傷具有較強(qiáng)的耐受能力，其作用機(jī)制可能是通過抑皋t J T N F —o 表達(dá)、抑制肝細(xì)胞的凋亡發(fā)生引起的。關(guān)鍵詞：