腺病毒載體轉(zhuǎn)染mIL-4基因?qū)π∈笠浦残呐K保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分:大鼠頸部異位心臟移植模型的建立及術(shù)中常見問題的分析和處理目的：建立大鼠頸部異位心臟移植模型，分析手術(shù)過程中常見的問題并處理，為快速掌握該技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。方法：以SD大鼠為供體，Wistar大鼠為受體建立大鼠頸部異位心臟移植模型。觀察手術(shù)過程中各環(huán)節(jié)出現(xiàn)的問題并加以改進(jìn)。結(jié)果：常見的問題有動靜脈梗阻、出血，心臟不復(fù)跳，麻醉效果差等。經(jīng)過方法的改進(jìn)可以減少和避免問題的出現(xiàn)。結(jié)論：只要處理好常見的幾個問題，就可以很快的提高手術(shù)成功

2、率。 第二部分:HTK液和UW液對大鼠原代心肌細(xì)胞冷保存的保護(hù)作用目的：研究HTK液和UW液對體外培養(yǎng)的大鼠原代心肌細(xì)胞冷保存中的保護(hù)作用。方法：體外培養(yǎng)大鼠原代心肌細(xì)胞，分別用生理鹽水，UW液和HTK液在0～4℃保存心肌細(xì)胞6h、8h、10h、12h。檢測保存液的AST和LDH-L，臺盼藍(lán)染色法計(jì)算心肌細(xì)胞的生存率。結(jié)果：UW液組和HTK液組的AST和LDH-L均比生理鹽水組極顯著低下，心肌細(xì)胞的生存率則極顯著的高于生理鹽水組

3、。而在12h，HTK液組的AST和LDH-L顯著低于UW液組，心肌細(xì)胞的生存率在8h和10h也明顯高于UW液組。結(jié)論：HTK液和UW液均對體外培養(yǎng)的大鼠原代心肌細(xì)胞的冷保存有明顯的保護(hù)作用。而HTK液相對于UW液更能延長對心肌細(xì)胞的冷保存時(shí)間。 第三部分:1，6二磷酸果糖和HTK液對大鼠原代心肌細(xì)胞冷保存的保護(hù)作用目的研究1，6二磷酸果糖和HTK液在體外培養(yǎng)的大鼠原代心肌細(xì)胞冷保存中的保護(hù)作用。方法體外培養(yǎng)大鼠原代心肌細(xì)胞，分別

4、用生理鹽水(A組)、1，6二磷酸果糖(B組)、HTK液(C組)和1，6二磷酸果糖加HTK液的混合液(D組)在0～4℃保存心肌細(xì)胞6h、8h、10h。檢測保存液的ALT和LDH-L，心肌細(xì)胞Na+-K+ATPase活力，臺盼藍(lán)染色法計(jì)算心肌細(xì)胞的生存率。結(jié)果C組和D組的AST、LDH-L均比A組和B組顯著低下(P＜0.001)，細(xì)胞的Na+-K+ATPase活力和生存率則顯著提高(P＜0.001)。而在6h，D組的AST、LDH-L顯著低

5、于C組(P＜0.01)，心肌細(xì)胞的Na+-K+ATPase活力和生存率明顯高于C組(P＜0.01)。結(jié)論HTK液和1，6二磷酸果糖加HTK液的混合液均對體外培養(yǎng)的大鼠原代心肌細(xì)胞的冷保存有明顯的保護(hù)作用。而混合液相對于HTK液在短期內(nèi)對心肌細(xì)胞的冷保存有更好的效果。 第四部分:mIL-4基因腺病毒載體的構(gòu)建目的：構(gòu)建含mIL-4基因的重組腺病毒載體，并在血管內(nèi)皮細(xì)胞中進(jìn)行蛋白表達(dá)鑒定。方法：用限制性內(nèi)切酶酶切DFG-mIL-4-

6、Neo質(zhì)粒得到mIL-4基因，將mIL-4的cDNA插入到腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdShuttle-CMV，線性化后與腺病毒骨架載體pAdEasy-1電穿孔共轉(zhuǎn)染E.coli菌株BJ5183，使之同源重組，產(chǎn)生腺病毒基因組質(zhì)粒(pAd-mIL-4)，然后經(jīng)PacⅠ酶切線性化，脂質(zhì)體介導(dǎo)pAd-mIL-4轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝出具有感染力的復(fù)制缺陷型的重組腺病毒載體Ad-mIL-4。擴(kuò)增后收獲病毒，氯化銫密度梯度離心純化，檢測病毒滴度。重組腺病毒

7、感染小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，應(yīng)用ELISA法檢測上清液中mIL-4的水平，觀察mIL-4蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：DNA測序分析表明克隆的mIL-4基因與文獻(xiàn)報(bào)道一致，酶切鑒定證實(shí)mIL-4基因正確地插入表達(dá)載體中。重組腺病毒純化后病毒滴度達(dá)到5×109pfu/ml。應(yīng)用ELISA法檢測上清液，mIL-4的水平在血管內(nèi)皮細(xì)胞中獲得高效表達(dá)。結(jié)論：成功構(gòu)建了含有mIL-4基因的重組腺病毒載體，重組腺病毒能有效介導(dǎo)mIL-4基因在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，為

8、進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。 第五部分腺病毒載體轉(zhuǎn)染mIL-4基因?qū)π∈笠浦残呐K的保護(hù)作用目的研究腺病毒載體轉(zhuǎn)染mIL-4基因?qū)π∈笠浦残呐K的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。方法首先構(gòu)建含有mIL-4基因的腺病毒載體，以小鼠頸部心臟移植模型基礎(chǔ)，將Ad-mIL-4經(jīng)冠狀動脈注入供心后，在0～4℃的FDP+HTK液的混合液中保存2h，植于小鼠頸部。術(shù)后分別在1d、2d、3d、5d用ELISA法測血清中mIL-4的濃度，觀察移植心