重組腺病毒介導aFGF基因轉(zhuǎn)染的心肌細胞移植治療缺血性心臟病的實驗研究.pdf

1、研究目的:缺血性心臟病是當代人類發(fā)病率和致死率較高的疾病之一,由于冠狀動脈的狹窄和閉塞導致供血區(qū)域的心肌細胞因缺血和缺氧而壞死,梗死區(qū)逐漸被纖維疤痕所替代,影響了心肌局部的收縮和舒張功能,致左心室腔內(nèi)血液不能有效排空,心室內(nèi)壓增高,隨著左心室擴張及心室構(gòu)型的變化,即左室重構(gòu)的發(fā)生,逐漸出現(xiàn)充血性心力衰竭的癥狀.目前主要的治療措施是行藥物治療、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術、冠狀動脈旁路移植術、甚至行心臟移植術.上述治療雖已取得很大的進步,但仍有

2、約5％的患者因病變彌散、缺乏血管橋和吻合血管,以及手術風險高等原因,致使上述的治療不能進行或者效果不佳.而以細胞移植來替代壞死的心肌細胞,以及通過血管生長因子促進梗死區(qū)局部的血管新生,給患者提供了一種全新的治療方法.該實驗將構(gòu)建攜帶aFGF基因的復制缺陷型腺病毒Ad.aFGF,在體外轉(zhuǎn)染心肌細胞并檢測其轉(zhuǎn)染效率、蛋白表達及對血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞的促增殖作用.然后將轉(zhuǎn)染了Ad.aFGF的心肌細胞移植入大鼠的心肌缺血梗死區(qū),觀察移植

3、細胞的存活,促血管新生,以及對心功能的改善作用.研究方法:1、aFGF基因重組腺病毒(Ad.aFGF)的構(gòu)建;提取人脾臟組織mRNA,經(jīng)RT-PCR合成aFGF基因,再將其插入帶有腺病毒基因組的粘粒載體pAxCAwt中,擴增后挑選插入方向正確的克隆,應用磷酸鈣共沉淀法及DNA-TPC制備Ad.aFGF,將酶切鑒定為正確的病毒克隆進一步擴增、純化和鑒定滴度.2、Ad.aFGF轉(zhuǎn)染心肌細胞后aFGF的表達、分泌及對血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細

4、胞促增殖作用的研究;以不同MOI值的Ad.aFGF轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的心肌細胞,測定轉(zhuǎn)染效率,采用XTT法檢測轉(zhuǎn)染的安全性,以Western blot和ELISA檢測轉(zhuǎn)染后aFGF在細胞內(nèi)的表達及細胞外的分泌情況,再半含有aFGF的培養(yǎng)液加入體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞,用細胞計數(shù)和XTT檢測其促增殖作用.3、轉(zhuǎn)染Ad.aFGF的心肌細胞移植于心肌缺血梗死區(qū)的實驗研究;實驗動物為同基因背景的Lewis大鼠,共80只,結(jié)扎左冠狀動脈前

5、降支建立心肌梗死模型,4周后用于實驗.存活的60只大鼠隨機分為4組:組Ⅰ移植轉(zhuǎn)染了Ad.aFGF的心肌細胞(n=15);組Ⅱ移植轉(zhuǎn)染了Ad.LacZ的心肌細胞(n=15);組Ⅲ移植單純的心肌細胞(n=15);組Ⅳ注射培養(yǎng)液IMDM(n=15).移植后2周觀察移植細胞存活、血管新生以及心功能狀況.主要結(jié)論:1、構(gòu)建的Ad.aFGF腺病毒滴度高、純度好,能安全、高效地轉(zhuǎn)染心肌細胞,aFGF基因在細胞內(nèi)和細胞外均能有效表達,并有較強的促血管內(nèi)