轉(zhuǎn)染HRE-VEGF基因的骨髓間充質(zhì)干細胞自體移植治療缺血性心肌病的研究.pdf

1、研究表明干細胞移植可以取代壞死心肌細胞、增加有功能的心肌細胞數(shù)量，增加血管密度，改善心功能，從而為治療缺血性心肌病開辟了一條嶄新的途徑。改善缺血心肌的首要任務(wù)就是改善血供，血管內(nèi)皮生長因子（vascularendotheliumgrowthfactor，VEGF）在血管新生方面具有重要意義。雖然通過過表達VEGF的基因治療可以改善心肌缺血，但是卻不能控制VEGF的過度表達而產(chǎn)生癌變。本實驗通過低氧反應(yīng)元件（hypoxicresponse

2、element，HRE）控制VEGF的表達，使骨髓間充質(zhì)干細胞在低氧下表達VEGF，而常氧下VEGF表達關(guān)閉，研究受HRE調(diào)控的VEGF基因轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細胞能否在缺血、缺氧狀態(tài)下保護心肌細胞，促進血管再生，同時又防止VEGF基因過度表達，從而為基因修飾干細胞治療缺血性心肌病提供理論依據(jù)。 第一部分：大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）的分離、培養(yǎng)及心梗模型的建立 第一節(jié)、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）的分離、培養(yǎng)

3、 目的：建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)方法，為自體骨髓移植提供材料。 方法：大鼠的骨髓MSCs分離純化后，流式細胞儀檢測細胞周期。 結(jié)果：體外培養(yǎng)的原代MSCs10～14d達到匯合，細胞周期顯示75%的細胞處于G0/G1期。 結(jié)論：根據(jù)黏附特性分離的大鼠骨髓MSCs在體外條件下可生長擴增，可用于自體骨髓移植。 第二節(jié)、心梗模型的建立 目的：用液氮冷凍法建立大鼠心梗模型。 方法：對大鼠

4、用液氮中浸泡過的金屬棒直接接觸左室前壁，建立心梗模型。 結(jié)果：心超資料顯示建模前心功能與建模后心功能比有統(tǒng)計學(xué)差異，建模前的心功能明顯好于建模后。 結(jié)論：液氮冷凍法可以成功構(gòu)建心梗模型。 第二部分：HRE—VEGF表達載體的構(gòu)建 第一節(jié)、VEGF表達載體的構(gòu)建 目的：克隆VEGF的cDNA，將其與表達載體結(jié)合，構(gòu)建成VEGF—cDNA表達載體。 方法：根據(jù)已經(jīng)公布的VEGF的CDS功能區(qū)的

5、基因序列，應(yīng)用RT—PCR技術(shù)從HepG2細胞中擴增VEGF基因（1239bp），并將其克隆至載體pCDH1—MCS1—EF1—copGFP，構(gòu)建VEGF表達載體，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌。選擇陽性克隆菌，行雙酶切鑒定和測序驗證所獲取的cDNA。 結(jié)果：雙酶切鑒定和測序結(jié)果均表明所獲取的cDNA為VEGF的CDS功能區(qū)基因。 結(jié)論：使用RT—PCR法成功構(gòu)建VEGF表達載體。 第二節(jié)、HRE—VEGF表達載體的構(gòu)

6、建 目的：人工設(shè)計低氧反應(yīng)元件串聯(lián)重復(fù)序列，克隆后插入VEGF目的基因表達載體并經(jīng)測序證實。 方法：按照人促紅細胞生成素基因3’末端HRE增強子序列，人工設(shè)計合成首尾末端部分互補的單鏈DNA通過3次酶切、連接的方法獲得9HRE，然后通過退火及延伸合成兩端帶有酶切位點的包含9個串聯(lián)排布的HRE的雙鏈DNA，克隆到VEGF表達載體后測序。 結(jié)果：雙酶切鑒定和測序結(jié)果均表明所獲取的經(jīng)測序證實9HRE—VEGF和設(shè)計相符

7、。 結(jié)論：運用同尾酶法可成功構(gòu)建9拷貝缺氧反應(yīng)元件，構(gòu)建9HRE—VEGF表達載體。 第三部分：慢病毒介導(dǎo)HRE—VEGF基因轉(zhuǎn)染MSCs及HRE對轉(zhuǎn)基因MSCs在缺氧、復(fù)氧心肌細胞中的調(diào)控作用 第一節(jié)、慢病毒介導(dǎo)HRE—VEGF基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞 目的：用慢病毒系統(tǒng)（pPACKHl—LentivectorPackagingKit）將目的基因HRE—VEGF包裝并轉(zhuǎn)染干細胞。 方法：結(jié)合HR

8、E—VEGF的穿梭質(zhì)粒pCDH1轉(zhuǎn)染包裝細胞293T細胞進行擴增后，使用由三個質(zhì)粒組成的慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)進行基因重組，并以其為載體轉(zhuǎn)染鼠的骨髓間充質(zhì)于細胞，檢測其熒光的表達。 結(jié)果：293T細胞和MSCs24轉(zhuǎn)染小時和48小時后，均可檢測到強熒光出現(xiàn)。 結(jié)論：慢病毒載體系統(tǒng)攜帶目的基因HRE—VEGF基因轉(zhuǎn)染鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞具有較高的轉(zhuǎn)染效率。 第二節(jié)、轉(zhuǎn)基因骨髓間充質(zhì)干細胞對缺氧心肌細胞的影響 目的：

9、低氧反應(yīng)元件對缺氧、復(fù)氧心肌細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的VEGF基因表達的調(diào)控。 方法：原代培養(yǎng)心肌細胞，按不同的干細胞加入不同缺氧、復(fù)氧時間將心肌細胞分組，每組細胞固定后做免疫熒光染色測細胞內(nèi)VEGF蛋白的表達情況；RT—PCR測細胞內(nèi)人VEGF—mRNA含量；取細胞培養(yǎng)液ELISA法檢測人VEGF含量。 結(jié)果：在缺氧組檢測到VEGF—mRNA和VEGF蛋白的表達，而常氧組未檢測到VEGF—mRNA和VEGF蛋白的表達。 結(jié)論：

10、離體培養(yǎng)大鼠心肌細胞在低氧、復(fù)氧過程中加入攜帶HRE—VEGF基因的骨髓間充質(zhì)干細胞時，其中的HRE對轉(zhuǎn)導(dǎo)的VEGF基因表達具有調(diào)控作用。 第四部分：轉(zhuǎn)HRE—VEGF基因的MSCs自體移植對大鼠缺血性心肌病的實驗研究 目的：以心梗的大鼠為模型，研究移植轉(zhuǎn)染HRE—VEGF基因的自體MSCs能否在體內(nèi)較未轉(zhuǎn)基因的MSCs更顯著地改善缺血性心肌病大鼠的心臟功能，進一步探討MSCs聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染用于治療缺血性心肌病的可行性。

11、 方法：選用雄性Fischer344大鼠，體重200～250g，應(yīng)用液氮冷凍法建立心梗模型，行血流動力學(xué)檢測心功能。動物分成4組：空白組（A組，n=20）、DMEM組（B組，n=20）、MSCs組（C組，n=20）和轉(zhuǎn)基因組（D組，n=20）。從大鼠股骨取骨髓，用貼壁篩選方法分離純化、體外擴增MSCs，MSCs體外轉(zhuǎn)染慢病毒包裝的HRE—VEGF基因。將BrdU標(biāo)記的自體MSCs直接注射到梗死區(qū)。4周后，重復(fù)心功能檢查，評估心功能

12、和梗死區(qū)的灌注；并觀察心臟組織的病理學(xué)變化。采用ELISA法檢測血漿VEGF在梗死后和干細胞移植前后的變化，以及檢測Cx—43，Ⅷ因子等指標(biāo)觀察不同的處理對血管新生的影響。 結(jié)果：大鼠MSCs移植后4周，血流動力學(xué)測定顯示，C、D組LVDP較A、B組升高（P<0．05），左心室壓力變化率士dp/dtmaxC、D組明顯優(yōu)于A、B組（P<0．05）。D組與C組相比：D組±dp/dtmax較高。移植的MSCs能防止梗塞區(qū)變薄和擴張；與

13、A、B兩組和移植前相比，梗死區(qū)的收縮功能和血流灌注均有所改善（P<0．05），心功能的改善在D組更為明顯（與C組比較，P<0．05）。與A、B兩組相比，C、D組梗死區(qū)的毛細血管密度明顯增加（P<0．05），其中D組較C組增加明顯（P<0．05）。VEGF的水平在梗死后有所增加，在細胞移植后一周出現(xiàn)高峰，后逐漸下降。 結(jié)論：轉(zhuǎn)染HRE—VEGF的MSCs可以改善缺血心肌的左室功能，促進血管新生。這種改善可能是MSCs通過心肌再生防