肝細胞生長因子基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞治療心肌病心力衰竭的實驗研究.pdf

1、第一部分攜帶肝細胞生長因子的腺病毒在骨髓間充質(zhì)干細胞細胞的表達 目的： 將帶有人肝細胞生長因子(hHGF)和綠色熒光蛋白(GFP)基因的腺病毒載體，感染大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)，觀察其感染率及hHGF的表達。 方法： 將構(gòu)建好的攜帶hHGF基因的腺病毒載體(Ad-hHGF)和攜帶GFP基因的腺病毒載體(Ad-GFP)進行體外擴增、病毒滴度測定，提取新鮮骨髓，體外分離、培養(yǎng)并鑒定MSCs。將帶有hH

2、GF和GFP基因的腺病毒載體，感染第3-4代MSCs，通過流式細胞儀觀察感染率及通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測hHGF在MSCs中的表達。 結(jié)果： 病毒擴增后噬斑試驗測定Ad-GFP的病毒滴度為7.8 ×1010pfu/ml，Ad-hHGF的病毒滴度為1.3 ×1010 pfu/ml。Ad-GFP感染MSCs，感染率隨MOI的增加而增加，當感染復(fù)數(shù)(MOI)值為100時，感染率達到99.3％。ELISA檢測結(jié)果顯

3、示，Ad-hHGF感染MSCs第8天，hHGF表達含量達到峰值(22mg/ml)，16天時，仍可檢測到hHGF。 結(jié)論： ①MSC是一種理想的基因載體細胞，可用于HGF的基因治療。 ②感染Ad-hHGF的MSC，HGF有短期(2周左右)和高效表達。 第二部分 Ad-hHGF-rMSCs靜脈移植對大鼠心肌病心力衰竭功能及機理的研究 目的： Ad-httGF 感染MSCs后，經(jīng)尾靜脈注入心肌病

4、心力衰竭大鼠體內(nèi)，觀察其在心肌內(nèi)存活情況及各組大鼠心功能、血生化等指標的變化，并探討引起變化的機制。 方法： 通過腹腔注射阿霉素制作SD大鼠心肌病心力衰竭模型，隨機分為模型組、MSCs組、MSCs-hHGF組和正常對照組，MSCs-hHGF組經(jīng)尾靜脈注射Ad-hHGF感染的MSC 3x106/100ul，MSCs組注射MSCs 3x106/100ul，模型組和正常對照組注射磷酸鹽緩沖液(PBS)各100ul，各組大鼠分別

5、于移植后不同時間收集血漿檢測hHGF蛋白，移植后4周，應(yīng)用生理信號系統(tǒng)檢測心功能，并收集各組大鼠血漿檢測心鈉肽(ANP)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、內(nèi)皮素(ET)、肌鈣蛋白T(TnT)，白介素-6(IL-6)等內(nèi)分泌指標。HE染色及電鏡觀察各組大鼠心肌組織病理改變情況，天狼星紅染色觀察膠原增生，同時在熒光顯微鏡下觀察移植細胞的分布情況，免疫組化技術(shù)檢測Ⅷ因子和轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β 1)的表達。 結(jié)果： MS

6、Cs-hHGF組大鼠血漿中可以檢測到hHGF蛋白的表達，第9天含量最高，4周后仍可檢測到，而其他組并沒有檢測到。與模型照相比，MSCs組和MSCs-hHGF組大鼠心功能明顯改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)，而兩移植組間亦有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，MSCs-hHGF組優(yōu)于MSCs組。移植后4周，MSC-HGF組和MSC組血漿中TNF-a的放射性計數(shù)(cpm)值較模型組增高(p<0.05)，ET、ANP明顯增高(p<0.01)cT

7、nT明顯降低(p<0.01)，三組之間，IL-6無統(tǒng)計學(xué)意義。與MSC組相比較，MSC-HGF組血漿ANP、ET的CPM明顯增高(p<0.01) cTnT明顯降低(p<0.01)，IL-6和TNF-a兩組之間沒有顯著差別。大鼠組織學(xué)觀察，與模型組相比，兩移植組心肌組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)較好。兩移植組在熒光激發(fā)下均可見4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI)標記的陽性細胞聚集在病變心肌并存活，其中MSCs-hHGF組中可見更多存活的DAPI標記的細胞