骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療新生大鼠缺氧缺血性腦病的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:利用體外生物誘導(dǎo)方法研究BMSCs的神經(jīng)分化能力,免疫熒光技術(shù)檢測Nestin表達(dá):利用transwell體外遷移模型觀察BMSCs向缺氧缺血性腦組織的遷移能力。
　　 方法:參照Rice等和國內(nèi)吳婉芳等的方法,制作HIBD模型。造模24h后,將大鼠斷頭處死,剪開顱骨,觀察雙側(cè)大腦半球的大體形態(tài),然后在冰板上迅速分離患側(cè)大腦半球并立即置于液氮中,之后凍存于-80℃冰箱中備用。取出腦組織,稱重,用0.9％預(yù)冷到4℃的生理鹽水

2、按1:9制備成10％的腦組織勻漿,4℃×3000g×10min離心,留上清。
　　 2周齡SD大鼠4-6只,頸部脫臼處死,無菌條件下取出雙側(cè)股骨,剪開兩側(cè)干骺端,沖洗骨髓腔,制成單細(xì)胞懸液,移入25ml塑料培養(yǎng)瓶中,37℃,5％CO2飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),三天后首次換液,去除未貼壁細(xì)胞,以后每三天換液一次,倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞達(dá)到80％-90％融合時,用0.25％胰蛋白酶消化,按1:3比例傳代培養(yǎng)。
　　 待第

3、四代細(xì)胞達(dá)到90％融合時,取約1×106個細(xì)胞懸于100μlPBS中,分別加入適量FITC標(biāo)記CD29、CD31、CD44、CD45、CD90抗體避光染色30分鐘。后用1％多聚甲醛600μl重懸,流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。
　　 選用3-5代的BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化,以5x104/ml密度接種于事先放置涂有多聚賴氨酸蓋玻片的六孔板內(nèi)制備細(xì)胞爬片。細(xì)胞達(dá)80％融合時,將造模24h后HIBD鼠及8日齡正常鼠左腦上清液、右腦上清液與BMSC

4、s共培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞變化。共培養(yǎng)24h后,正常腦組織誘導(dǎo)組、HIBD誘導(dǎo)組、未誘導(dǎo)組蓋玻片取出,4％多聚甲醛固定30min,PBS洗滌,1％Triton-X-100破膜,PBS洗滌,正常山羊血清室溫封閉15min,加入Nestin抗體(1:100),濕盒4℃冰箱過夜。從冰箱拿出后,室溫復(fù)溫40min,PBS漂洗3次,加入二抗,山羊抗兔IgG-FITC(1:100)避光孵育30min,PBS漂洗3次,Depy復(fù)染核,甘油封片,陰性

5、對照用PBS取代一抗。熒光顯微鏡下計(jì)算陽性率。
　　 在Transwell上室的聚加入DMEM稀釋后Matrigel,合成凝膠碳酸酯膜上。按5×104/cm2密度,配成細(xì)胞懸液,接種于上室,只加DMEM,不加FBS,每孔100μl。HIBD組、正常腦組織組、DMEM+FBS組、單純DMEM組每組10孔,下室中加入各種條件培養(yǎng)基500ul,HIBD組中條件培養(yǎng)基為HIBD腦組織上清液100μl,加入DMEM培養(yǎng)液中配成的含F(xiàn)BS1

6、5％培養(yǎng)基；正常腦組織組中由正常腦組織上清液代替HIBD腦組織上清液；DMEM+FBS組的條件培養(yǎng)基為含15％FBS的DMEM；單純DMEM組只加DMEM,不加FBS。后置于37℃培養(yǎng)箱中,孵育24h；取出transwell用PBS洗2遍,5％戊二醛固定,4℃；加入蘇木素染色,用棉球擦去上表面細(xì)胞,顯微鏡下觀察。
　　 結(jié)果:細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中后4-6h開始貼壁,10-14d后細(xì)胞貼壁細(xì)胞達(dá)到80-90％融合,1:2比例進(jìn)行傳代

7、,至第三代細(xì)胞為成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞,胞體細(xì)長呈纖維狀,細(xì)胞核較大,形態(tài)為均一的紡錘形。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測,大鼠BMSCs表面CD29(99.83％)、CD44(99.77％)、CD90(99.86％)陽性,CD31(0.83％)、CD34(1.78％)、CD45(2.9096)陰性。
　　 BMSCs與腦組織上清液共培養(yǎng)24h后細(xì)胞形態(tài)逐漸發(fā)生變化:原來寬大扁平的長梭形細(xì)胞胞體回縮,變圓,后逐漸伸出突起,突起逐漸增多,有些逐漸伸長,

8、類似神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)。各組細(xì)胞進(jìn)行Nestin免疫熒光染色表明,細(xì)胞誘導(dǎo)24h后免疫細(xì)胞熒光檢HIBD誘導(dǎo)組、正常腦組織誘導(dǎo)組細(xì)胞均有Nestin表達(dá),陽性率分別為(31.76±3.56)％、(19.46±2.61)％,未誘導(dǎo)組Nestin陽性率為(2.57±0.73)％,陰性對照組未檢測到熒光。HIBD腦組織上清液誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)Nestin陽性率高于正常腦組織上清液誘導(dǎo)組(P<0.01)。
　　 鏡下可見不同比例BMSCs向下室遷

9、移情況。單純DMEM組細(xì)胞遷移率(2.69±0.74)％,DMEM+FBS組為(14.91±1.54)％,正常腦組織組為(20.18±4.86)％,HIBD組為(39.42±2.81)％,其中腦損傷24h組向下室遷移細(xì)胞最多,與其他各組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。左右腦相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論:大鼠BMSCs可通過直接貼壁法進(jìn)行體外培養(yǎng),獲得細(xì)胞純度較高,細(xì)胞大多呈有序的漩渦狀排列。培養(yǎng)過程中偶爾會出現(xiàn)早衰細(xì)胞,因