ad.vsghbcl2的構(gòu)建及其在大鼠移植肝缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用

1、9 5 7 曩0 0博士學(xué)位論文( 2 0 0 6 屆)A d ．V S G ．h B C L ．2 的構(gòu)建及其在大鼠移植肝缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用T h e C o n s t r u c t i o no f A d ．V S G ．h B C L ．2a n d I t sP r o t e c t i v eE f f e c to n G r a f t s o f R a t L i v e r T r a n s p l

2、 a n t a t i o na g a i n s tI s c h e m i a R e p e r f u s i o n I n j u r y研究生姓名指導(dǎo)教師姓名專業(yè)名稱研究方向論文提交日期虐型壁盞渣鑫[ 墊拯』益鹽疊壁壁壁蕉星Q Q 魚(yú)疊壘笪A d ．V S G - h B c ] - - 2 的構(gòu)建及其在大鼠移植肝缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用 中文提要P D C 3 1 2 ．C M V 的多克隆位點(diǎn)。鑒定、篩選包含目

3、的基因的正確克隆，將其與5 型腺病毒右臂質(zhì)粒p P E 3 一起用l i p o f e c t a m i n e 共轉(zhuǎn)染至2 9 3 細(xì)胞中，使其在2 9 3 細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組及包裝。用P c R 法鑒定后，在2 9 3 細(xì)胞中大量擴(kuò)增，密度梯度離心純化。結(jié)果：產(chǎn)物經(jīng)鑒定后為包含有B c ! ．2 全長(zhǎng)序列的重組腺病毒載體A d ．V S G ．h B C L ．2 ，B c l ．2 基因位于其C M V 啟動(dòng)子控制之下。

4、經(jīng)擴(kuò)增純化后濃度為1 ．7 0X 1 0 加p f u ／m l ，共3 m l 。結(jié)論：C r e 酶介導(dǎo)的L o x P 位點(diǎn)特異性重組是一種簡(jiǎn)單、高效的腺病毒載體構(gòu)建方法，具有構(gòu)建速度快、成功率高、準(zhǔn)確率高等特點(diǎn)。第三部分：目的：觀測(cè)構(gòu)建的A d ．V S G ．h B C L ．2 腺病毒載體在大鼠體內(nèi)的表達(dá)及其在大鼠原位移植肝缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用。方法：術(shù)前3 6 ／] , 時(shí)將A d ．V S G ．b B C L ．

5、2 通過(guò)門(mén)靜脈注入實(shí)驗(yàn)組供體大鼠肝臟，3 ．0×1 0 9 p f u ，只。供肝獲取后將其保存在4 “ C - 孥L 酸鈉林格氏液中4 d , 時(shí)，兩袖套法行原位肝臟移植術(shù)。門(mén)靜脈復(fù)流6 小時(shí)后觀測(cè)兩組受體膽汁分泌情況，處死受體大鼠，檢測(cè)血漿中A S T 、A L T 、L D H 水平，切取肝臟組織，W e s t e r n B l o t t i n g 檢測(cè)B c I ．2 的表達(dá)，免疫組化法檢測(cè)T N F ．旺、B

6、 c l - 2 和B a x 表達(dá)，T U N E L 法檢測(cè)肝臟組織的細(xì)胞凋亡，電鏡觀察肝臟組織的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果：術(shù)后6 d , 時(shí)，W e s t e r n B l o t t i n g 顯示實(shí)驗(yàn)組肝臟組織高表達(dá)B c l ．2 ，對(duì)照組僅痕量表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組膽汁分泌量多于對(duì)照組，A S T 、A L T 、L D H 水平明顯低于對(duì)照組。免疫組化顯示實(shí)驗(yàn)組肝臟中B c l ．2 表達(dá)明顯升高，B a x 表達(dá)下降，而對(duì)照組

7、T N F ．- n 、B a x表達(dá)顯著增高，B c l 一2 呈陰性。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)變化較輕，凋亡水平明顯低于對(duì)照組。結(jié)論：構(gòu)建的A d ．V S G ．h 1 3 C L - 2 可以在大鼠體內(nèi)有效表達(dá)。經(jīng)門(mén)靜脈注射的方法( 3 ．O ×1 0 9 p f u ／R ) 可以有效的將目的基因轉(zhuǎn)染入大鼠肝臟。高表達(dá)B c l - 2 的移植肝對(duì)缺血再灌注損傷具有較強(qiáng)的耐受能力，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制T N F ．a(chǎn) 及B