FLIP腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)Ⅱ型AEC、PVEC的抗凋亡作用的初步研究.pdf

1、目的及意義：ALI/ARDS是戰(zhàn)時(shí)及日常臨床工作中常見的危重癥之一。過去10－15年ALI/ARDS的病死率有所下降，但仍高達(dá)40％。目前，對(duì)ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，臨床上缺乏特效治療方法，現(xiàn)仍以對(duì)癥和支持治療為主要手段。故研究新的治療策略是臨床學(xué)家所關(guān)注的熱點(diǎn)問題。FLIP是一種細(xì)胞凋亡的抑制蛋白，它在結(jié)構(gòu)和序列上與caspase-8具有同源性，但由于在caspase-8中起催化作用的兩個(gè)氨基酸殘基Cys、His分別被

2、Tyr、Arg所替代，從而使FLIP喪失了蛋白水解酶活性。FLIP可以與caspase-8競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合FADD，阻斷DISC的組裝，從而抑制細(xì)胞凋亡。近年來，普遍認(rèn)為ALI/ARDS是嚴(yán)重創(chuàng)傷和膿毒癥等引發(fā)的過度炎癥反應(yīng)。多形核白細(xì)胞(PMN)、AEC、PVEC等多種細(xì)胞及細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)參與了ALI/ARDS的發(fā)病過程。其中，AEC、PVEC凋亡引起的呼吸膜通透性增高，在ALI/ARDS的發(fā)病中起著關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞

3、(alveolar epithelial cell，AEC)、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary vascular endothelial cell，PVEC)凋亡在ALI/ARDS發(fā)病中的重要地位，利用FLIP競(jìng)爭(zhēng)性抑制caspase-8的特點(diǎn)，通過AdMax系統(tǒng)構(gòu)建FLIP重組體腺病毒感染Ⅱ型AEC、PVEC，從而抑制其凋亡，阻斷ALI/ARDS的發(fā)病進(jìn)程，本實(shí)驗(yàn)研究將為下一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.

4、構(gòu)建FLIP重組體腺病毒：根據(jù)Ⅱ型AEC、PVEC凋亡在ALI/ARDS發(fā)病中的重要地位，利用FLIP可競(jìng)爭(zhēng)性抑制caspase-8，阻斷DISC形成，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)，通過含有大鼠FLIP全長(zhǎng)基因的原始載體及AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)，構(gòu)建FLIP重組體腺病毒Ad-FLIP,包裝產(chǎn)生出病毒后，經(jīng)EcoRI+NheI雙酶切及PCR鑒定構(gòu)建是否正確,后擴(kuò)增病毒，測(cè)定病毒滴度；
　　2.培養(yǎng)并感染大鼠Ⅱ型AEC(購(gòu)于ATCC)：根

5、據(jù)測(cè)定Ad－FLIP的MOI值感染大鼠Ⅱ型AEC，感染24h后，通過RT-PCR及western blot方法檢測(cè)感染組及各對(duì)照組Ⅱ型AEC中FLIP的mRNA及蛋白表達(dá)，比較有無差異；通過細(xì)胞毒性Fas單克隆抗體(CH-11)誘導(dǎo)感染組及對(duì)照組Ⅱ型AEC發(fā)生凋亡，通過流式細(xì)胞儀分析兩組細(xì)胞間早中期凋亡率的差別，隨后經(jīng)western blot方法分析凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)變化；四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)并比較兩組細(xì)胞活性，分光

6、光度計(jì)法檢測(cè)并比較兩組細(xì)胞內(nèi)caspase-3的活力；
　　3．培養(yǎng)并感染大鼠PVEC：采用大鼠經(jīng)典原代培養(yǎng)方法培養(yǎng)大鼠PVEC，原代培養(yǎng)的大鼠PVEC經(jīng)光鏡觀察及Ⅷ因子間接免疫熒光鑒定培養(yǎng)是否成功。根據(jù)測(cè)定Ad-FLIP的MOI值感染大鼠PVEC，感染24h后，通過RT-PCR及westernblot方法檢測(cè)感染組及各對(duì)照組PVEC中FLIP的mRNA及蛋白表達(dá)，比較有無差異。隨后，通過細(xì)胞毒性Fas單克隆抗體(CH-11)誘導(dǎo)

7、感染組及對(duì)照組PVEC發(fā)生凋亡，通過流式細(xì)胞儀分析感染組及對(duì)照組間早中期凋亡率的差別。
　　結(jié)果：
　　1.利用含有大鼠FLIP全長(zhǎng)基因的原始載體及Ad-Max腺病毒包裝系統(tǒng)，包裝出含有大鼠FLIP基因的腺病毒Ad-FLIP，經(jīng)EcoRI+NheI雙酶切及PCR鑒定復(fù)合預(yù)期結(jié)果，構(gòu)建正確；測(cè)定病毒滴度v.p./mL:2.3×1011，TCID50/ml:7.1×109；
　　2．重組腺病毒Ad-FLIP感染大鼠Ⅱ型AE

8、C24h后，經(jīng)RT-PCR及western blot方法檢測(cè)感染細(xì)胞內(nèi)FLIP的mRNA及蛋白表達(dá)明顯增加。細(xì)胞毒性Fas單克隆抗體(CH-11)誘導(dǎo)感染組及對(duì)照組Ⅱ型AEC發(fā)生凋亡，通過流式細(xì)胞儀分析Ad-FLIP感染組細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組(p<0.05)。同時(shí)MTT結(jié)果提示，CH-11對(duì)兩組細(xì)胞的活力均有抑制作用，且呈濃度依賴性，但感染組細(xì)胞較對(duì)照組有明顯的抵抗(p<0.05)。CH-11提高兩組細(xì)胞caspase-3的活力，但

9、FLIP可抑制caspase-3的活化(p<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)LIP可以抑制凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)；
　　3.重組腺病毒Ad-FLIP感染大鼠PVEC24h后，經(jīng)RT-PCR及western blot方法檢測(cè)感染細(xì)胞內(nèi)FLIP的mRNA及蛋白表達(dá)明顯增加。細(xì)胞毒性Fas單克隆抗體(CH-11)誘導(dǎo)感染組及對(duì)照組PVEC發(fā)生凋亡，通過流式細(xì)胞儀分析Ad-FLIP感染組細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組(p<0.