FLIP重組腺病毒在體抑制Ⅱ型AEC、PVEC凋亡及其對ALI防治作用的研究.pdf

1、目的
　　ALI/ARDS是一種較為常見的嚴(yán)重急性進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭，盡管在過去的20年對其防治進(jìn)行了深入研究，由于其發(fā)病機制尚未完全明確，臨床上缺乏特效治療方法，仍以器官功能和全身支持治療為主，尤其是呼吸支持治療，故其病死率雖有所下降，但仍高達(dá)40％。因此，研究新的治療策略仍是近年來所關(guān)注的熱點問題。細(xì)胞凋亡在ALI/ARDS發(fā)病中起著重要作用。肺泡上皮細(xì)胞（AEC）、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞（PVEC）凋亡會引起呼吸膜通透性增高，導(dǎo)致

2、滲透性肺水腫、微小肺不張和肺血管阻力增高等改變，是ALI/ARDS發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。故抑制AEC、PVEC凋亡可能是防治ALI的重要途徑和手段。脂多糖（LPS）和TNF-α等可通過激活Caspase-8誘導(dǎo)AEC、PVEC凋亡，而Fas相關(guān)死亡域樣白介素1-β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白（FLIP）是一種與Caspase-8有顯著同源性的抗凋亡蛋白，它可以與Caspase-8競爭性結(jié)合FADD，阻斷DISC的組裝，從而抑制細(xì)胞凋亡。本課題組前期體外

3、研究已證實：FLIP重組體腺病毒（Ad-FLIP）可明顯抑制經(jīng)Fas誘導(dǎo)的AEC、PVEC細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步驗證Ad-FLIP在動物實驗中的抗凋亡保護(hù)作用，我們利用Ad-FLIP溶液滴鼻吸入感染大鼠，檢測其對肺組織FLIP表達(dá)水平的影響并評價對大鼠ALI/ARDS的防治效果；觀察其對Ⅱ型AEC、PVEC細(xì)胞凋亡的抑制作用并探討可能的機制。這將為ALI/ARDS的基因治療提供重要的實驗依據(jù)。
　　方法
　　1.Ad-FLIP最

4、佳表達(dá)時間確定：按滴鼻后處死動物的時間將24只SD大鼠隨機分為4組,每組6只。1％戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉后，予Ad-EGFP腺病毒500ul/kg滴鼻吸入以感染各組SD大鼠，分別于吸入后24h、48h、72h和96h處死各組大鼠，熒光顯微鏡下觀察各組大鼠的肺熒光蛋白EGFP表達(dá)。
　　2.Ad-FLIP在體研究動物分組：48只SD大鼠隨機分為4組，每組12只。①FLIP治療組：先經(jīng)腹腔注射脂多糖（LPS）5mg/kg

5、4－6h成功制備出內(nèi)毒素型大鼠ALI模型，之后以1％的戊巴比妥鈉50mg/kg充分麻醉，予FLIP腺病毒溶液（2.3×1011vp/ml）500ul/kg滴鼻以感染ALI大鼠；②對照治療組：建立ALI模型（腹腔注射LPS5mg/kg4－6h）后，以Ad-EGFP（3.4×1011vp/ml）腺病毒溶液500ul/kg滴鼻作為對照。③FLIP預(yù)防組：先予FLIP腺病毒500ul/kg滴鼻預(yù)處理感染SD大鼠，48h后制備大鼠ALI模型；④對

6、照預(yù)防組：先予以Ad-EGFP腺病毒吸入作為預(yù)防對照，48后制備大鼠ALI模型。
　　3.觀察Ad-FLIP對肺組織FLIP表達(dá)的影響及ALI/ARDS的防治作用：采用RT-PCR和免疫組織化學(xué)染色方法檢測各組大鼠的肺組織FLIPmRNA及蛋白表達(dá)；觀察各組大鼠的一般情況、肺大體標(biāo)本、肺組織病理學(xué)改變，測定各組大鼠的肺呼吸膜的通透性以及肺損傷評分。
　　4.觀察各組大鼠的肺組織凋亡狀況：透射電鏡下觀察各組大鼠Ⅱ型AEC、PV

7、EC的凋亡狀況；提取肺組織DNA，瓊脂糖凝膠電泳觀察DNALadder的形成；WesternBlot和免疫組織化學(xué)染色法分別檢測各組大鼠的肺組織凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)。
　　結(jié)果
　　1.熒光顯微鏡下觀察結(jié)果提示：Ad-EGFP腺病毒滴鼻吸入能明顯提升大鼠的肺組織EGFP黃綠色熒光的表達(dá)，其中48h表達(dá)最強。
　　2.FLIP治療組和FLIP預(yù)防組大鼠的肺組織FLIPmRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于其各自對照

8、組（P<0.01）；且大鼠的一般情況較好，肺大體標(biāo)本和組織病理學(xué)改變減輕，肺損傷積分降低（P<0.05），肺通透性指數(shù)亦降低（P<0.01）。
　　3.FLIP治療組和FLIP預(yù)防組大鼠的肺Ⅱ型AEC、PVEC凋亡的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且無明顯的DNALadder現(xiàn)象。肺組織凋亡相關(guān)蛋白Bax水平表達(dá)降低，而Bcl-2的表達(dá)上調(diào)（P<0.01），Bax/Bcl-2比值降低。
　　結(jié)論
　　通過滴鼻吸入的方法能夠使大鼠成功