膀胱上皮特異性重組腺病毒的構(gòu)建及其抑制作用.pdf

1、背景： 膀胱癌的基因治療途徑已顯現(xiàn)研究前景。重組腺病毒目前用于基因治療。目的基因在靶組織中的差異表達(dá)在基因治療中很重要，一種方法是用組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)治療基因表達(dá)。本研究是構(gòu)建膀胱上皮特異性重組腺病毒，探討其在膀胱癌細(xì)胞中的抑制作用。 方法： RT-PCR分析用于鑒定幾種細(xì)胞株中huPII和柯薩奇腺病毒受體(CAR)的表達(dá)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和熒光素酶檢測試驗(yàn)用于鑒定hUPII啟動(dòng)子的組織特異性。從RpS-TOAD-P

2、SE-PBN-E1A載體酶切得到E1A片段。用引物從CP1131載體擴(kuò)增得到hUPII啟動(dòng)子片段。E1A片段和hUPII啟動(dòng)子片段插入穿梭載體RpS-TOAD建立Rp-UPII-E1A載體。從Rp-UPII-E1A載體中切除E1A片段建立Rp-UPII-Null載體。Rp-UPII-E1A和Rp-UPII-Null分別與pAdEasy-1通過電穿孔共轉(zhuǎn)染大腸桿菌BJ5183的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中用于大量擴(kuò)增。

3、兩種陽性質(zhì)粒Pac I酶切后通過Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。7天后收獲病毒。病毒在293細(xì)胞中增殖到足夠量后，用常規(guī)CsCl離心純化腺病毒。用UV-SDS法和TCID50法測定病毒滴度。提取Ad-UPII-E1A和Ad-UPII-Null的病毒DNA，用特異于E1A基因和UPII啟動(dòng)子的引物的PCR證實(shí)。用重組腺病毒Ad-UPII-E1A和Ad-UPII-Null感染細(xì)胞48小時(shí)后，用Western blot檢測E

4、1A蛋白在BIU-87細(xì)胞中的表達(dá)。檢測了重組腺病毒Ad-UPII-E1A在膀胱癌細(xì)胞株BIU-87中的抑制作用。 結(jié)果： 在膀胱癌細(xì)胞株BIU-87中表達(dá)hUPII和柯薩奇腺病毒受體(CAR)。在膀胱癌細(xì)胞株BIU-87中hUPII啟動(dòng)子活性高。用細(xì)菌中同源重組技術(shù)把hUPII啟動(dòng)子和E1A基因插入5型重組腺病毒基因組中。在Ad-UPII-E1A的病毒DNA中有E1A基因和UPII啟動(dòng)子，在Ad-UPII-Null的病