肝癌特異性靶標(biāo)致敏DC誘導(dǎo)CIK對肝癌抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:抗原負(fù)載或刺激DC細(xì)胞，能夠增強(qiáng)DC的免疫性及抗原提呈作用，然后再將DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)，可以使DC-CIK細(xì)胞發(fā)揮更好的特異性抗腫瘤作用。體外培養(yǎng)DC關(guān)鍵一步是選擇何種形式的抗原來刺激DC，目前臨床應(yīng)用的DC細(xì)胞主要是利用手術(shù)切除腫瘤組織的裂解產(chǎn)物沖擊致敏DC。采用腫瘤組織凍融裂解物可以有效促進(jìn)DC的成熟，但是對于不能手術(shù)的晚期腫瘤病人，得不到相應(yīng)的腫瘤抗原，因而不能誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤特異性的DC，這樣就妨礙了DC細(xì)胞臨床應(yīng)用的

2、范圍。通過對DC抗原提呈原理的分析可知，DC對腫瘤抗原的提呈過程是將完整的抗原在胞漿中降解成多肽，多肽轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)與新組裝的MHC-Ⅰ類分子結(jié)合，而后通過高爾基體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面，細(xì)胞表面MHC-Ⅰ類分子結(jié)合的多肽被免疫性識別，從而導(dǎo)致效應(yīng)細(xì)胞的活化。由此可見，DC提呈的是多肽，效應(yīng)細(xì)胞識別的也是多肽。特異性腫瘤遞呈靶標(biāo)就是多條腫瘤組織特異性抗原肽的復(fù)合物，其是經(jīng)過龐雜的程序從腫瘤組織中篩選出來的腫瘤特異的、確定性的靶標(biāo)序列。本研究即

3、是通過用肝癌特異性腫瘤遞呈靶標(biāo)致敏DC后與CIK共培養(yǎng)后對HuH-7肝癌細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)外殺傷和抑制來觀察其療效，探求特異性腫瘤遞呈靶標(biāo)致敏DC的臨床可行性和應(yīng)用價(jià)值。
　　方法:
　　1.從健康人外周血中密度梯度離心分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)后收集貼壁細(xì)胞，利用IL-4、GM-CSF細(xì)胞因子刺激培養(yǎng)DC，分別利用肝癌特異性DC靶標(biāo)或者肝癌HuH-7細(xì)胞凍融抗原沖擊致敏DC。檢測DC表面標(biāo)志成熟的分子CD80、CD83、CD

4、86、HLA-DR以及單核細(xì)胞標(biāo)志CD14的表達(dá)情況，評價(jià)DC成熟程度;ELISA法檢測DC細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子分泌水平的差異。
　　2.從健康人外周血中密度梯度離心分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)后收集懸浮細(xì)胞，利用IFN-γ，CD3 mAb、IL-2、IL-1α等細(xì)胞因子刺激培養(yǎng)CIK。CIK細(xì)胞與經(jīng)不同種類腫瘤抗原致敏的DC混合培養(yǎng)，檢測CIK細(xì)胞表面CD3、CD56分子的表達(dá)情況，ELISA法檢測效應(yīng)細(xì)胞因子IFN-γ的分

5、泌水平的差異。
　　3.培養(yǎng)HuH-7肝癌細(xì)胞，利用不同組CIK細(xì)胞作用于HuH-7細(xì)胞24小時(shí)后，去除懸浮的效應(yīng)細(xì)胞，CCK-8試劑檢測貼壁的靶細(xì)胞存活情況，比較單純CIK細(xì)胞、肝癌特異性DC靶標(biāo)致敏DC誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞以及肝癌HuH-7細(xì)胞凍融抗原致敏DC誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞對肝癌細(xì)胞殺傷活性的不同。
　　4.裸鼠皮下注射HuH-7細(xì)胞懸液構(gòu)建裸鼠肝癌移植瘤模型，DC-CIK細(xì)胞由尾靜脈注入荷瘤裸鼠，觀察荷瘤裸鼠腫瘤體積的變

6、化，比較不同種類腫瘤抗原致敏DC后對荷瘤裸鼠的抑瘤作用的不同。
　　結(jié)果:
　　1.負(fù)載腫瘤抗原后，DC細(xì)胞分泌IL-12 p70顯著增強(qiáng)。利用肝癌特異性DC靶標(biāo)致敏后，DC培養(yǎng)上清IL-12 p70分泌量為173.33±6.66 pg/ml，與HuH-7細(xì)胞凍融抗原致敏的DC分泌水平179.33±14.04 pg/ml相似，明顯高于對照組59.33±11.84 pg/ml。DCHuH-7 vs control，P＜0.01

7、;DCtarget vscontrol，P＜0.01。
　　2.與負(fù)載肝癌特異性DC靶標(biāo)的DC共培養(yǎng)和與負(fù)載肝癌細(xì)胞凍融抗原的DC共培養(yǎng)一樣均可以顯著增強(qiáng)CIK細(xì)胞分泌IFN-γ的能力，前者IFN-γ分泌量為345±22.34 pg/ml，后者IFN-γ分泌量為380.67±10.11 pg/ml，和單獨(dú)培養(yǎng)的CIK對照組（166.67±11.23 pg/ml）比較，P值均＜0.01。負(fù)載肝癌特異性靶標(biāo)抗原的DC作用稍弱（DCHu

8、H-7 vs DCtarget，P＞0.05）。
　　3.用CCK-8法測定在10∶1、20∶1、40∶1和100∶1四種效靶比下不同培養(yǎng)方式的CIK細(xì)胞對肝癌細(xì)胞HuH-7的殺傷活性。結(jié)果顯示，隨著效靶比的增加，各組CIK細(xì)胞對靶細(xì)胞HuH-7的殺傷活性均逐漸增強(qiáng)。在同一個(gè)效靶比中，對HuH-7細(xì)胞的殺傷活性強(qiáng)弱排序?yàn)?DCHuH-7-CIK細(xì)胞＞ DCtarget-CIK細(xì)胞＞CIK細(xì)胞。DCHuH-7-CIK細(xì)胞組以及DCt

9、arget-CIK細(xì)胞對HuH-7細(xì)胞株的殺傷活性明顯高于單純CIK細(xì)胞(P＜0.05)，但DCHuH-7-CIK組與DCtarget-CIK組比較差異不顯著(P＞0.05)。
　　4.測定不同培養(yǎng)方式的CIK細(xì)胞對裸鼠肝癌移植瘤的抑瘤作用。CIK細(xì)胞治療組平均抑瘤率為54.69％，DCHuH-7-CIK細(xì)胞治療組平均抑瘤率為85.78％，DCtarget-CIK細(xì)胞治療組平均抑瘤率為78.48％。CIK、DCHuH-7-CIK以

10、及DCtarget-CIK三組細(xì)胞都能明顯抑制裸鼠肝癌移植瘤的生長，瘤結(jié)節(jié)增大的速度放緩，與未經(jīng)治療的對照組相比，CIK治療組P值＜0.05，DCHuH-7-CIK治療組及DCtarget-CIK治療組P值均＜0.01。DCtarget-CIK細(xì)胞對腫瘤的抑制作用與DCHuH-7-CIK細(xì)胞相仿(P=0.998＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.肝癌特異性DC靶標(biāo)可成功致敏DC。負(fù)載肝癌特異性DC靶標(biāo)后，DC細(xì)胞分泌IL-1

11、2 p70顯著增加;與其共培養(yǎng)后，DC-CIK細(xì)胞分泌效應(yīng)細(xì)胞因子IFN-γ的能力明顯提高。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，負(fù)載肝癌特異性DC靶標(biāo)的DC細(xì)胞可明顯提高CIK細(xì)胞對肝癌細(xì)胞株HuH-7的殺傷活性。
　　3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，負(fù)載肝癌特異性DC靶標(biāo)的DC細(xì)胞可明顯提高CIK細(xì)胞對裸鼠體內(nèi)肝癌移植瘤的抑制作用。
　　4.在臨床患者不能或不易獲取腫瘤抗原時(shí)，肝癌特異性靶標(biāo)可替代肝癌組織抗原負(fù)載DC進(jìn)行細(xì)胞治療，能夠取得與腫