特異性HER-2 siRNA對BT-474細胞抑制作用的實驗研究.pdf

1、南方醫(yī)科大學博士學位論文特異性HER2siRNA對BT474細胞抑制作用的實驗研究姓名：張緒慧申請學位級別：博士專業(yè)：腫瘤學指導教師：羅榮城20070416中文摘要效的替代基因敲除的工具，它在功能基因組學研究、基因治療等領(lǐng)域越來越得到更多的重視。。本研究選擇HER02過表達的乳腺癌BT珥74細胞株為研究對象，應用RNAi技術(shù)沉默該BT474細胞中的HER2基因，觀察其抗癌的作用，并對其作用機制進行了初步探討研究目的：設(shè)計并構(gòu)建針對HER

2、2mRNA的特異性RNA干擾質(zhì)粒載體，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株，通過體外和體內(nèi)實驗研究特異性HER2siRNA對BT474細胞HER2的干擾作用，及其對BT珥74細胞的抑制作用，為RNAi技術(shù)用于防治乳腺癌提供基礎(chǔ)的實驗依據(jù)。研究方法：1根據(jù)人HER2mRNA基因編碼區(qū)序列，設(shè)計并合成針對HER2的3條小發(fā)夾RNA(shRNA)]溪板脫氧寡核苷酸序列(siRSAI、siRNA2及siRNA3)和l條作為負對照的無關(guān)序列(siRNAneg)。

3、利用pRNATU61／Neo載體質(zhì)粒構(gòu)建了3種特異性HER2siRNA質(zhì)粒(pRNATU61／NeosiRNA1、pRNATU61／NeosiRNA2及pRNATU61／Neo—siRNA3)和1種無關(guān)序列質(zhì)粒pRNATU61／NeosiRNAneg2通過陽性克隆PCR鑒定及DNA測序鑒定來驗證構(gòu)建的重組質(zhì)粒是否符合實驗要求。3在陽離子脂質(zhì)體介導下，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HER2過表達的人乳腺癌BT珥74細胞株，篩選出陽性穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細胞

4、進行克隆，分別采用RTPCR和Westernblot技術(shù)檢測HEI沌mRNA和HER2蛋白表達的交化，用M，盯比色法和平板克隆形成試驗檢測細胞增殖活性，采用流式細胞儀測定細胞周期變化和細胞凋亡情況，采用運動小室實驗檢測細胞的運動侵襲能力4用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的BT珥74細胞建立裸鼠皮下移植瘤模型，觀察腫瘤生長情況，測量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，接種后第30d處死裸鼠并剝離瘤體，稱量瘤體重量并計算抑瘤率，采用RTPCR檢測HER2基因水平